芹菜素（洋甘菊提取物）延缓人脐静脉内皮细胞衰老的体外实验研究

发布时间:2014-04-29 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1449

研究表明，衰老的内皮细胞中一氧化氮(NO) 生成减少，活性氧簇(ROS)生成增多，从而引发内皮功能性障碍及各种心血管疾病。提示，可通过延缓内皮细胞的衰老进程来预防心血管疾病的发生。而人内皮细胞的衰老过程受多种因素的影响和调节[1-4 3。

洋甘菊提取物芹菜素(apigenin)是天然存在的一种天然黄酮类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中，具有抗肿瘤、抗炎、降血压、抗动脉硬化和血栓、抗焦虑、抗菌抗病毒以及抗氧化等多种药理活性 J，但对细胞衰老过程的直接影响尚未见有报道。本文旨在研究芹菜素对体外培养的人脐静脉内皮细胞衰老的延缓作用及其相关机制。

1 仪器与材料

3llO型CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)； FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton Dickinson 公司)。M199培养基(Invitrogen公司)；双氢罗丹明 (dihydrorhodamin 123，DHR，Sigma公司)；／3一半乳糖苷酶检测试剂盒(欣百诺公司)；NO检测试剂盒 (Cayman chemicals公司)；芹菜素(色谱纯，由上海医药工业研究院王震宇博士惠赠)；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2．1 细胞培养

参照文献[1]方法，鉴定并培养人脐静脉内皮细胞，直至第12代(老年细胞)。其间，自第4代细胞(幼年细胞)起，与芹菜素(1、3、10 p~mol·L )共孵育，每48小时更换1次共孵液。

2．2 细胞衰老程度的测定

一半乳糖苷酶(SA卢一ga1)的活性可表征细胞衰老的程度，通常该酶在衰老细胞中高表达。采用文献[6]方法，将内皮细胞固定，检测其SA 一gal阳性率，以此推断细胞的衰老程度。

2．3 细胞中活性氧簇水平的测定

DHR是一种极易被氧化的亲脂性染料，可自由穿过细胞膜，进人细胞后可被ROS(主要为超氧化物、过氧化氢和过氧化亚硝基)氧化成带有正电荷、能发出荧光的Rh123，并被泵人线粒体内，从而滞留和累积在细胞内。采用流式细胞仪(激发波长：

488 nm；发射波长：525 nm)检测细胞内Rh123的荧光强度，以此判断细胞内ROS水平。通过流式细胞仪所配置的软件对所测数据进行处理，每个样品测定10 000个活细胞，采用直方图分析获得的平均荧光强度(MFI)，该值即代表细胞ROS水平。

2．4 细胞中一氧化氮水平的测定

硝酸盐／亚硝酸盐是细胞中NO的稳定代谢物，其在细胞培养液中的含量可表征细胞中NO水平。吸取细胞培养液上清，3 000 r·min 离心10分钟，于一20℃存放，然后用NO检测试剂盒检测其硝酸盐／亚硝酸盐含量，以此推断细胞中NO水平。

2．5 统计方法

所有数据均用元±s表示。用t检验或ANOVA 进行统计学分析，组间检验采用post hoc Tukey S

3 结果

3．1 洋甘菊提取物芹菜素致细胞一半乳糖苷酶阳性率降低作用考察

与幼年细胞组相比，老年细胞对照组内皮细胞 SA 一gal阳性率提高了约10倍。在老年细胞组中，与未加芹菜素的对照组相比，芹菜素组(1、3、 10 Ixmol·L )内皮细胞中SA 一gal阳性率呈洋甘菊提取物芹菜素剂量依赖性降低，其中10 I~mol·L 剂量组降低最明显，达27％，提示芹菜素可延缓内皮细胞的衰老 (见图1)。

3．2 洋甘菊提取物芹菜素致细胞中活性氧簇水平降低及一氧化氮水平升高作用考察

与幼年细胞组相比，老年细胞对照组细胞中ROS 水平上升了约3倍。在老年细胞组中，与未加芹菜素的对照组相比，芹菜素组(1、3、10~xrnol·L )内皮细胞中ROS水平呈芹菜素剂量依赖性下降，其中 10 I~mol·L 剂量组下降最明显，达46％(见图2)。

与幼年细胞组相比，老年细胞对照组培养液上清中硝酸盐／亚硝酸盐含量下降了约50％。在老年细胞组中，与未加芹菜素的对照组相比，芹菜索组 (1、3、10 Ixmol·L )培养液上清中硝酸盐／亚硝酸盐含量呈芹菜素剂量依赖性增加，其中10 p~mol·L 剂量组增加最明显，达1．73倍(见图3)。

4 讨论

内皮细胞衰老是诱发各种心血管疾病的风险因素之一，随着生理年龄的增长，内皮可发生功能性障碍而诱发各种心血管损害墙J。已有大量研究表明，内皮细胞在衰老过程中，其胞内NADPH氧化酶、线粒体及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的功能易发生异常，从而使得ROS水平上升；且许多疾病均与自由基的大量产生即氧化应激有关，如癌症、心血管疾病、缺血／再灌损伤、风湿性关节炎、糖尿病、神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病)等。本试验首次证明，芹菜素可以延缓体外培养的人脐静脉内皮细胞衰老，并且该作用与内皮细胞中ROS的生成减少以及NO的生成增加有关。早在20世纪50 年代，Harman(J Gerontol，1956年)就提出“氧化应激决定寿命”，即自由基衰老学说，氧化应激被认为是衰老的主要原因之一。NO对内皮细胞的衰老也具有重要的调节作用，NO供体可以延缓内皮细胞的衰老 J。而芹菜素则可能至少部分是通过降低胞内ROS的水平和增加NO的合成而延缓内皮细胞衰老。

洋甘菊提取物芹菜素能够延缓内皮的衰老，提示其可能具阻止或逆转老年性内皮衰老的作用，从而有利于心血管疾病的预防和治疗。当然，本试验只是在离体条件下的体外研究，至于芹菜素在体内的抗衰老作用及其确切的分子机制，仍有待于进一步验证。