HPLC法测定Beagle犬血浆中芹菜素的浓度

 芹菜素(apigenin)属于黄酮类化合物，广泛存在于水果、 蔬菜、豆类、茶叶中。一，其中芹菜含量最高。车前子、络石藤、 藿香等药用植物中均含有大量芹菜素口一。研究发现，其有抗癌、抗病毒、抗菌、抗过敏，抗血管脆性和血小板聚集及抗糖 尿病并发症等多种生理活性与药理作用，对人类的肿瘤、衰 老、心血管病等退行性疾病的治疗和预防有重要意义[3 。

 许多研究表明，黄酮类在肝脏二相代谢酶的作用下，可发生葡萄糖醛酸化和硫酸化反应，因此芹菜素在血浆中有部分以葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物存在--，导致游离的芹 菜素含量降低，无法准确测得结果 。我们将芹菜素静脉给 药后的犬血浆样品经葡萄糖醛酸酶及硫酸酯酶水解后发现，血浆药物芹菜素浓度显著高于未水解血浆。因此将含药血 浆酶解后再进行测定，使其葡萄糖醛酸、硫酸酯及其他结合 物均能水解成游离的单体进行测定以考察其浓度更为合理。目前芹菜素的血药浓度测定和药代动力学研究尚在起步阶段，动物模型建立不多。本实验采用酶解法，建立HPI C法 测定Beagle犬血浆中芹菜素浓度，为芹菜素的临床研究提供参考。

 1 材料

 1．1 仪器HPLC—Agilent 1100(VWD，手动进样器)； ChemStation for LC (Agilent CO．LTD)；XW一80A漩涡}昆合 器(上海精科实业有限公司)；Eppendorf Centifuge 5415 R (Eppendorf AG 22331 Hamburg)。

 1．2 试剂 芹菜素对照品(Lot l11K1520，SIGMA— ALDRICH CO．)；8一葡萄糖苷酸酶(IX—A)和硫酸酯酶(H一1) 均购自Sigma公司；甲醇(色谱纯)；醋酸铵(分析纯)；乙酸乙 酯(分析纯)；盐酸(分析纯)；超纯水。

 2 方法和结果

 2．1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil ODS C-8色谱柱(250 mm×4．6 mm，5“m)；流动相：甲醇一O．2 醋酸铵溶液(50： 5O， ／ )；流速：1．0 ml·min_。；紫外检测波长：336 nm；进 样量：5O“l；柱温：25℃ 。色谱图见图1。芹菜素保留时间 9．5 rain，空白血浆色中，杂质峰不干扰测定，表明该方法专 属性好。

 2．2 血样采集受试Beagle犬(体质量l2．0～ 15．0 kg，浙 江大学医学院实验动物中心提供)禁食12 h，于后肢静脉给 芹菜素(60 mg·ml )10 ml。分别于给药后0、0．2、8．0 h由 前肢取静脉血约0．5 ml，300×g离心10 min，分离出血浆，冷冻保存。

 2．3 血浆预处理 精密移取血浆0．3 ml，漩涡震荡加入 0．23 tool·L 盐酸30 l，使酸化。加入p葡萄糖苷酸酶(300 U·ml )和硫酸酯酶(15 U ·ml )各5 l，38C水浴振荡水解1．5 h后，置于冰浴中加入3．0 ml乙酸乙酯，立即密封，旋涡 振荡5 rain，400×g离心10 rain，精密移取2．0 ml上清液于另一干净试管中，于真空干燥器中抽干。测定前加流动相200 ttl 溶解，1 000×g离心5 min，取上清液5O l进样。

 2．4 标准溶液的配制及标准曲线的制备 精密称取芹菜素对照品50．0 mg，置5O ml量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度， 摇匀，即成芹菜素标准储备液。临用前以甲醇稀释成所需浓度的标准液。

 于0．3 ml空白血浆中分别加入系列浓度的芹菜素标准 液，使其血浆药浓分别为0．673 2、2．681、10．70、21．43、 32．15、42．88“g·ml_。，按2．3项下条件操作。以样品峰面 积为Y，以血浆芹菜素浓度为x，进行线性回归，其直线方程 y一59．O7x+2．962，r一0．999 7(”一6)。血浆芹菜素最低检测浓度为0．083 73“g-ml (S／N≥3)。

 2．5 方法学观察

 2．5．1 绝对回收率 精密量取芹菜素标准储备液适量，加 入空白血浆，配置成芹菜素浓度为0．673 2、1O．7O、42．88 g·ml 的低、中、高浓度的标准血样溶液各5份，按2．3项 下条件操作，记录峰面积与对应浓度的芹菜素标准溶液所得峰面积之比，得绝对回收率为95．65 ～98．58 。

 2．5．2 加样回收率 精密量取芹菜素标准储存液适量，加 入空白血浆，配置成芹菜素浓度为0．673 2、1O．7O、42．88 g·m1 的低、中、高浓度的标准血样溶液各5份，按2．3项 下条件操作，将峰面积代人标准曲线得到各质量浓度测定值，与加入量之比得到加样回收率为98．98 ～101．9 。

 2．5．3 精密度考察 按加样回收率项下，配制浓度为 0．673 2、lO．7O、42．88 g·m1 的血浆样品各5份，依2．3 项下条件操作，于l d内测定，计算日内RSD 为0．9 ～ 1．2 ；问隔1～ 2 d，于2周内考察，所得的日间RSD 为 3．0 ～ 4．1 。

 2．5．4 稳定性实验 取芹菜素血浆浓度为0．673 2，42．88 g·ml 的低、高浓度样品各3份，按2．4项下处理操作。在冷冻保存24 h后，于室温(25℃)解冻，连续测定3次，各浓 度下的回收率为97．44 ～ 103．5 ，表明冻融后样品稳 定。

 2．5．5 酶解与未酶解血样比较 Beagle犬静脉给药后，按2．2 项条件采集血样。将血样分别按照经酶解及未经酶解过程，其余均按照2．3项下条件操作，各时间点血药浓度见表l。

 由表1可见，各时问点的血样经酶解过程后所得芹菜素浓度均高于未经酶解过程处理的血样(P<="">

 3 讨论

 流动相中加入醋酸铵溶液可抑制芹菜素的酚羟基电离， 改善分离效果，减少拖尾，并因为其酸性，使峰形尖锐。采用乙酸乙酯为提取溶剂，回收率理想，并且不影响芹菜素的稳 定性。采用336 nrn ^ 为检测波长，比较灵敏且干扰较少。

 芹菜素在体内存在部分葡萄糖醛酸及硫酸酯结合物。 表1的结果显示，未酶解的血浆样品的芹菜素含量明显低于 酶解的血浆样品，因此不经水解或酶解直接测定其中的芹菜素不能准确反映总浓度，从而不能合理反映芹菜素在体内的 吸收、利用情况。曾考虑使用盐酸水解，经预实验发现色谱 图中有较多杂质峰干扰实验。后参考文献 使用 葡萄糖苷酸酶及硫酸酯酶，更具有针对性，且对芹菜素图谱无干扰。此外通过正交实验最终确定酶的浓度为 葡萄糖苷酸酶 (300 U ·ml )和硫酸酯酶(15 U ·ml )，在此条件下可酶 解完全。

 综上所述，本方法用于测定Beagle犬血浆中芹菜素，不 仅方法准确、方便，而且干扰少、灵敏度高，可满足药代动力学及临床研究的要求。