中药厚朴提取物对人白血病细胞作用初探

发布时间:2013-12-19 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1806

[摘要]目的:研究中药厚朴提取物和厚朴酚与厚朴酚对白血病细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法:用MTT、AnnexinV、凋亡DNALadder等实验,观察和厚朴酚与厚朴酚对白血病K562、HL-60和U937细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用。结果:和厚朴酚实验组对K562、HL-60和U937有增殖抑制作用,呈剂量时间依赖性,且对K562、HL-60和U937有诱导凋亡

作用;厚朴酚对HL-60有增殖抑制作用,并呈剂量时间依赖性,但与和厚朴酚联合用药无协同作用。结论:和厚朴酚与厚朴酚对白血病细胞株均有增殖抑制作用,且呈剂量时间依赖性,但二者之间无联合协同作用。

[关键词]厚朴;和厚朴酚;厚朴酚;白血病细胞

随着环境污染加重,白血病的患病率有上升趋势。目前白血病临床治疗首选化疗。但由于化疗药物的副作用和复发等问题,使得研发高效低毒的化疗药物迫在眉睫。研究发现,中药厚朴提取物和厚朴酚与厚朴酚有抗菌消炎,抗肿瘤等疗效。K562细胞株是第一个被分离建立的髓系白血病细胞系,表达BcrAbl融合基因, HL-60是人类幼稚粒细胞白血病细胞系, U937细胞株能分泌大量细胞和趋化因子(IL-1和GM-CSF)等。本研究以白血病K562、HL-60和U937细胞株为研究对象,探讨中药厚朴提取物和厚朴酚与厚朴酚对白血病细胞增殖抑制和诱导凋亡作用,研究中药抗肿瘤的物质基础和作用机制。

1　材料与方法

1·1　细胞培养

K562、HL-60、U937于CO2培养箱中37℃、体积分数5%的CO2常规培养, 2~3 d换液传代一次。

1·2　MTT实验

取各对数生长期培养细胞计数,再分别取1mL细胞(1×105个细胞)于24孔培养板中。设计6

个系列浓度,即分别依次加入和厚朴酚(终浓度0·0、20·0、40·0、60·0、80·0、100·0μmol/L),置于37℃, CO2培养箱中。分别在24、48、72 h取100μL细胞于96孔细胞培养板,加MTT(上海凌峰化学试剂有限公司,中国。5 mg/mL)10μL混匀,37℃放置4 h。然后,各加异丙醇溶液(V(HCl)∶V(异丙醇)=17∶5 000)100μL,混匀,在Multiskan spectrum酶标仪(Thermo Labsystems公司,美国)570 nm进行检测,计算并制作抑制率浓度曲线图。

用同样的MTT方法观察厚朴酚终浓度为0·0、10·0、20·0、30·0、40·0、50·0μmol/L作用HL-60 24、48及72 h,以及和厚朴酚、厚朴酚各自终浓度为0·0、6·3、12·5、25·0、50·0、100·0μmol/L联合作用HL-60 24、48和72 h,观察和厚朴酚与厚朴酚之间有无协同作用。

1·3　DNALadder分析

各取已加和厚朴酚20·0、40·0μmol/L的K562、HL60、U937细胞液适量(1×105个细胞),在37℃, CO2培养箱中培养24 h后,用DNA Ladder提取试剂盒(普利来基因有限公司,中国)提取细胞DNA进行电泳分析,当细胞发生凋亡时电泳图谱出现DNA条带。

1·4　流式细胞术分析

分别在上述K562、HL60、U937加入和厚朴酚终浓度为0·0、20·0、40·0μmol/L培养24 h后,取适量细胞用FITCAnnexinV/PI双染,进行流式细胞术分析。

1·5　联合用药的联合指数分析

用ChouTalalay公式计算两药联合作用白血病细胞的联合指数CI(CI=1叠加效应, CI<1协同,CI>1拮抗)。

1·6　统计学处理

用统计软件SPSS13·0对数据进行统计学分析。

2　结果

2·1　和厚朴酚对白血病细胞MTT实验结果(图1)

利用MTT实验分别观察和厚朴酚对K562、HL-60和U937增殖抑制作用,结果发现和厚朴酚对其均有增殖抑制作用,且呈剂量时间依赖。

2·2　和厚朴酚对白血病细胞DNAladder电泳实验结果

本实验按试剂盒说明书操作。当细胞发生凋亡时细胞DNA发生剪切,出现有规则的DNA片段。0·0、20·0、40·0μmol/L和厚朴酚分别作用K562、HL-60、U937 24 h后,进行DNA ladder电泳分析,在40·0μmol/L泳道出现了均匀的DNA片段条带。

2·3　和厚朴酚对白血病细胞的流式细胞分析(FITC AnnexinV/PI双染)实验结果(图2封3)细胞凋亡早期,细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内侧转移到外侧,使PS暴露在细胞膜表面与荧光标记AnnexinV特异性结合,通过流式细胞仪可检测和分析细胞凋亡数量。0·0、20·0、40·0μmol/L和厚朴酚分别作用K562、HL-60、U937 24 h后,进行流式细胞术分析。

2·4　厚朴酚及厚朴酚、和厚朴酚联合作用对HL-60的MTT实验结果(图3)

利用HL-60首先观察厚朴的另一种提取化合物厚朴酚对白血病细胞的增殖抑制作用,并通过统计学方法观察厚朴酚、和厚朴酚联合作用的效果。结果发现厚朴酚对HL-60也存在增殖抑制作用,但与和厚朴酚之间无联合协同作用,联合指数CI>1。

3　讨论

厚朴主要用于治疗胃肠功能紊乱,其干燥皮可提取活性药用成分和厚朴酚及厚朴酚。近年发现和厚朴酚具有明显的抗肿瘤活性,可明显抑制卵巢癌、乳腺癌等多种实体肿瘤增殖作用。中医药临床多用原药,原药厚朴中除含有和厚朴酚,还富含厚朴酚等天然活性化合物,因此我们利用MTT实验观察和厚朴酚与厚朴酚对三种白血病的增殖抑制和诱导凋亡作用。凋亡的显著特征是细胞内出现凋亡小体。是由染色体DNA断裂所致。断裂后形成了许多长约180

bp倍数的DNA片断,通过电泳照相显示为阶梯状,成为凋亡DNA Ladder,是细胞凋亡经典实验。DNALadder电泳实验结果显示和厚朴酚对三种白血病细胞有诱导凋亡作用。细胞早凋亡时,位于细胞膜内侧的PS可迁移至外侧,形成膜反转。标记上荧光素的磷脂酰结合蛋白V(Annexin V)对PS有高度的亲合力。图2显示当0·0、20·0、40·0μmol/L和厚朴酚分别作用于K562、HL-60、U937 24 h后,通过流式细胞仪检测到AnnexinV-FITC阳性细胞,显示和厚朴酚作用白血病细胞后发生PS膜反转,出现早期凋亡细胞,且凋亡细胞数量具有剂量依赖性。

图3A提示厚朴酚作用HL-60后其抑制率与和厚朴酚接近。说明和厚朴酚与厚朴酚活性化合物是抗肿瘤的物质基础。图3B为和厚朴酚与厚朴酚联合作用时通过统计学计算得到的联合指数,当联合厚朴酚对白血病细胞的增殖抑制作用,并通过统计学方法观察厚朴酚、和厚朴酚联合作用的效果。结果发现厚朴酚对HL-60也存在增殖抑制作用,但与和厚朴酚之间无联合协同作用,联合指数CI>1。

3　讨论

bp倍数的DNA片断,通过电泳照相显示为阶梯状,成为凋亡DNA Ladder,是细胞凋亡经典实验。DNALadder电泳实验结果显示和厚朴酚对三种白血病细胞有诱导凋亡作用。

细胞早期凋亡时,位于细胞膜内侧的PS可迁移至外侧,形成膜反转。标记上荧光素的磷脂酰结合蛋白V(Annexin V)对PS有高度的亲合力。图2显示当0·0、20·0、40·0μmol/L和厚朴酚分别作用于K562、HL-60、U937 24 h后,通过流式细胞仪检测到AnnexinVFITC阳性细胞,显示和厚朴酚作用白血病细胞后发生PS膜反转,出现早期凋亡细胞,且凋亡细胞数量具有剂量依赖性。

图3A提示厚朴酚作用HL-60后其抑制率与和厚朴酚接近。说明和厚朴酚与厚朴酚活性化合物是抗肿瘤的物质基础。图3B为和厚朴酚与厚朴酚联合作用时通过统计学计算得到的联合指数,当联合指数CI<1时表示二者有联合作用。和厚朴酚与厚朴酚联合作用HL-60在不同时间段联合指数CI>1,提示二者对HL-60无联合协同作用。综上所述,和厚朴酚与厚朴酚分别具有抑制K562、HL-60和U937增殖抑制或诱导凋亡作用,和厚朴酚与厚朴酚对HL-60的增殖抑制无协同联合作用,其结果为研发新的抗白血病治疗药物和厚朴的新用途提供了实验依据。