金银花中绿原酸的体外抑菌和抗氧化性的研究

发布时间:2013-12-19 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2841

摘　要:用紫外光谱法(UV)和高效液相色谱法(HPLC)对金银花中提取的绿原酸进行定性定量分析,测定了绿原酸对食品中常见的致病菌的抑菌能力,清除DPPH·自由基的能力和对Fe3+的还原能力。结果表明:金银花中绿原酸具有较强的抑菌效果,对自由基有较强的清除能力,对Fe3+有较强的还原能力。

关键词:金银花;绿原酸;抑菌;抗氧化

　　金银花在我国分布广,药用历史悠久,是常用的清热解毒药。金银花为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物忍冬(Lonicera japonica thunb)及同属多种植物的干燥花蕾,是临床常用的中药之一。近年来研究发现,金银花中富含多种对人体健康有益的物质,诸如挥发油黄酮及绿原酸类、三萜类和微量元素等,具有很高的利用价值。在众多的成分中绿原酸较为丰富且具有多种活性功能,因此常以绿原酸含量的高低评价金银花质量的优劣。

　　绿原酸是一种含有酚羟基的化合物,药理学证明,绿原酸具有保护心血管的活性。人体内的低密度脂蛋白(LDL)被氧化是引起心血管病的一个重要原因。绿原酸能有效地保护人体LDL中α-Tocopher o,l使其LDL免受氧化。当人体摄入一定量含有酚羟基化合物的食物时,这些物质可降低或淬灭人体中自由基的产生。据统计在心脏病低发病率的人群中,发病率与绿原酸的摄入有一定联系,其部分抗病机制是绿原酸对人体LDL中αTocopherol氧化的抑制作用。

　　本文在对金银花中绿原酸的抗菌、抗氧化活性等方面做一些探讨,为工业化生产该类物质提供一定的技术依据。

1　材料和方法

1.1　材料与仪器

1. 1. 1　试验材料

河南产金银花,经干燥后破碎。

1. 1. 2　试验菌株

　　大肠埃希氏菌(Escherichia Coli,G-),枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis,G+),金黄色葡萄球菌(Staphylo coccus aureus, G+),藤黄八叠球菌(Microccus luteus (Schroeter)Cohn,G+)购自于湖北武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1. 1. 3　培养基

　　固体肉汤培养基(g/L):蛋白胨10. 0,牛肉浸膏5. 0,NaCl5. 0,琼脂20. 0, pH 7. 2, 121℃灭菌20min;半固体肉汤培养基(g/L):蛋白胨10. 0,牛肉浸膏5. 0,NaCl5. 0,琼脂8. 0, pH 7. 2, 121℃灭菌20 min。

1. 1. 4　实验仪器

　　KDF2116康达多功能食品粉碎机(天津市达康电器公司),微量进样器(基因公司),ORION 818型pH计(美国), RE3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器), SHBⅢ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸),

AB204N分析天平(美国MettlerToledoGroup),Uvmini1240紫外可见分光光度计(日本岛津有限公司),高效液相色谱仪(美国Lab)。

1. 1. 5　主要试剂

　　CH3CH2OH、NaCl、FeCl3、K3Fe(CN)6、Na2HPO4、NaH2PO4、绿原酸标准品、2, 2-二苯基-α-苦基肼(DPPH)、抗坏血酸、三乙胺、三氯乙酸(均为分析纯),乙腈(色谱纯);庆大霉素(华北制药厂,生产批号:20040218, 80万单位/2mL),大孔树脂(南开大学化工厂)。

1.2　实验方法

1. 2. 1　绿原酸的基本提取工艺

　　金银花破碎颗粒→热回流浸提→浓缩→冷沉→离心→大孔树脂纯化→浓缩→冷藏保备用。

1. 2. 2　紫外分光光度法对金银花中绿原酸含量的测定

　　将绿原酸标准溶液配成浓度0. 01 mol/L,用紫外分光光度计于200~500 nm扫描。选取绿原酸的最大吸收波长,测定不同浓度标准溶液的吸光度值,做出标准曲线,以计算金银花中绿原酸的含量。

1. 2. 3　对金银花中绿原酸的定性分析

　　本试验利用高效液相色谱法(HPLC)在相同色谱条件下,将标准溶液色谱图与样品色谱图进行对照,根据保留时间确定样品中的绿原酸。

1. 2. 4　绿原酸抑菌活性实验———生物检测法

　　抑菌试验方法:无菌操作。取10 mL琼脂培养基于直径为9 cm的无菌培养皿中,铺匀,待凝固后,放入两个牛津杯。取含有活菌的半固体培养基10 mL,加到装有牛津杯的培养皿中,铺匀,待凝固后,拔出牛津杯,在其中一个杯孔中加入药液50μL,并设阴性对照和阳性对照, 37℃培养24 h观察结果,并测量抑菌环直径。抑菌环直径≥20 mm为极敏, 15~20 mm为高敏, 10~15 mm为中敏,≤10 mm为低敏。

1. 2. 5　绿原酸抗氧化性

　　本实验利用还原法测定了金银花中绿原酸在体外清除2, 2-二苯基-α-苦基肼自由基(DPPH·)的能力,并与抗坏血酸进行了还原Fe3+能力的对比。

(1)绿原酸清除DPPH·活性测定

　取0. 1 mL的精制绿原酸样品溶液,加入2. 9 mL0. 05g/L的DPPH·乙醇溶液。混匀后在517 nm处测定吸光度值,每1 min测量一次,直至读数稳定。

　　(2)绿原酸还原Fe3+能力的测定[7]

取2. 5 mL的不同样品溶液,加入2. 5 mL的磷酸盐缓冲液(0. 2 mol/L, pH =6. 6)及2. 5 mL的10-0K3Fe(CN)6溶液,于50℃水浴反应20 min后急速冷却,加入2. 5 mL的1000三氯乙酸溶液,取反应液5 mL,加入5 mL的H2O和0. 100FeCl3溶液1 mL,混合均匀, 10 min后于700 nm处测定其吸光度值,以水为空白,吸光度值越大表示还原能力越强。以上实验均以抗坏血酸作阳性对照。

2　结果与讨论

2.1　金银花中绿原酸的测定

通过对绿原酸标准溶液和在金银花中精制所得的绿原酸溶液用紫外分光光度计在200~500 nm扫描,见图1。由图1可以看出,由大孔吸附树脂精制所得的绿原酸和相同浓度的绿原酸标准品的紫外光谱图比较,二者都是在324 nm有一最大吸收峰,峰形和两峰峰高比例基本相同。最后选取最大吸收波长324 nm,再分别测定不同浓度标准绿原酸溶液的吸光度值,以绿原酸标准品浓度为横坐标,以其吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,如图2。　

根据所绘的标准曲线,求得线性回归方程为Y=57.497x+0.048 2,且相关系数R2=0.999 9,说明本方法在绿原酸的质量浓度为0. 005~0. 030 g/L时具有良好的线性关系。

利用大孔吸附树脂对粗提液进行的纯化使得产品的纯度由原来37. 99%提高到90. 38%,精制得率达90%以上。

　　结果表明, 1. 0 g/L的金银花中绿原酸的抑菌效果明显,尤其是大肠杆菌和藤黄八叠球菌,它们的抑菌圈直径分别是25. 95 mm和23. 55 mm即为极敏,金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径是19. 72 mm为高敏,枯草芽胞杆菌抑菌圈直径是13. 65 mm为中敏。庆大霉素虽对一些致病菌等具有强抑菌作用,但它对人体有肾

毒性、耳毒性、过敏反应等,而在金银花中提取的绿原酸的毒副作用还未见文献报道,又因为金银花来源丰富、价格低廉,所以金银花与庆大霉素等比较,在临床应用上更为安全、方便,可供临床选用防治致病菌等感染的参考。

2.4　绿原酸抗氧化性

2. 4. 1　绿原酸清除DPPH·测定

　　20世纪80年代,自由基对健康的影响日益为人们所认识,现代医学和营养保健学认为,自由基在人体内可直接引起许多疾病,而且与其他一些疾病的发

生也有关。

　　绿原酸是具有酚羟基的一类还原性化合物,在复杂反应体系中,由于其自身被氧化而具有抗氧化作用。其途径就是绿原酸分子的酚羟基与有害自由基反应变成较稳定的半醌式自由基,从而终止有害自由基的链式反应;其次是绿原酸通过自身的还原性质直接给出电子消耗掉有害自由基。深入研究绿原酸的抗氧化机理,对天然抗氧化剂的筛选,改进抗氧化剂的结构,获取性能更加优良的抗氧化剂具有重要意义。

　　2, 2-二苯基-α-苦基肼自由基(DPPH·)是一种很稳定的以氮为中心的自由基,若受试物能将其清除,则表示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH·有个单电子,在517 nm有强吸收,其乙醇溶液呈深紫色,加入受试物后,在517 nm处可以动态监测其对DPPH·的清除效果。绿原酸和抗坏血酸的清除DPPH·能力如图6所示。

　绿原酸与抗坏血酸清除DPPH·能力随时间的延长而增强,在反应到5min以后,绿原酸与抗坏血酸基本将DPPH·清除完全,而且绿原酸清除DPPH·能力比抗坏血酸要强。由此可以看出,绿原酸与自由基反应,能使自由基成为更为稳定的物质;绿原酸属于能与自由基快速反应的小分子化合物,因此它是潜在重要的生物抗氧化剂。

2. 4. 2　绿原酸和抗坏血酸还原力的比较

　　还原能力的测定,可检验化合物是否为良好的电子供应者。它所供应的电子可以使Fe3+还原为Fe2+,使体系溶液颜色改变,即可反映出体系中氧化还原状态的改变。加入化合物后,在700 nm处可以推知体系中Fe3+的变化。

　绿原酸和抗坏血酸还原Fe3+的能力如图7所示。由图7可以看出,体系溶液在较低的浓度时,绿原酸与抗坏血酸还原能力随浓度的增加而增强,而绿原酸的还原能力强于抗坏血酸。

3　结　论

　　利用牛津杯法测得1. 0 g/L金银花中绿原酸的抑菌结果为:大肠杆菌、藤黄八叠球菌对于绿原酸为极敏,金黄色葡萄球菌为高敏,枯草芽胞杆菌中敏。

　　从清除DPPH·能力上比较,绿原酸表现出了比抗坏血酸强的清除能力,并且随其浓度的增加清除能力呈上升趋势;从还原力上比较,较低浓度的绿原酸也远高出抗坏血酸的还原力。