摘要:目的　通过对大黄素的研究现状进行分析,为大黄素以及其他天然活性成分的开发提供理论依据。　方法　采取对大黄素的结构性质、提取方法、分离方法、测定方法、生物活性及研究展望等几个方面进行概述总结,全面描述大黄素的研究状况。　结果　通过分析得出各种提取、分离和测定方法的优缺点。　结论　高速逆流色谱提取方法和分光光度测定方法具有广阔发展前景。

关键词:大黄素;活性成分;提取;测定;高速逆流色谱;分光光度

　大黄素(Emodin)是一种羟基蒽醌的衍生物,分子式为C15H10O5。其是分布最广泛的一种蒽醌类物质,从许多霉菌、地衣、高等植物及昆虫中均有发现,广泛存在于大黄的根茎、鼠

李的树皮和根皮、决明的种子中。

1　大黄素的结构及性质

1·1　结构　大黄素是由八个醋酸单位生物合成而来的,结果见图1。

1·2　物理性质　橙色针状晶体,熔点256~257℃;不溶于水,能溶于乙醇,稍溶于乙醚、氯仿、苯,溶于苛性碱水溶液、碳酸钠溶液或氨溶液中并显樱红色。

1·3　酸性　从它的结构可以看出,在1、8α位上有两个酚羟基,在β位3上有一个羟基。因此分子表现出一定的酸性。但是由于α-OH与=O基形成稳定的分子内氢键而使其酸性减弱,而其也具有一个β-OH,所以大黄素可以溶于Na2CO3溶液和氢氧化钠溶液。

1·4　颜色反应　当滴加氨水或碱液时,其颜色加深,呈现微红色,这与形成共轭体系的酚羟基和羰基有关。由于大黄素两个环上各有一个α-OH,所以当其与MgAc2溶液反应时呈现橙红或者粉红色。大黄素与浓硫酸反应呈红色。

2　提取方法

总体而言,游离蒽醌的提取方法主要有两种:有机溶剂提取法和酸碱提取法。有机溶剂提取法可采用氯仿、苯等有机溶剂直接进行提取,提取液在浓缩过程中有时会有结晶析出。也可用甲醇或者乙醇进行抽提,提取液浓缩后再用不同的溶剂进行分配或用不同pH值的水溶液进行萃取而达到初步分离的目的。由于蒽醌衍生物大多数含有酚羟基或羧基,在植物体内与钠、钾、钙、镁等金属离子结合,以盐的形式存在,所以在提取时可用酸使之完全游离出来,然后再进行提取。酸碱提取法是因为绝大部分的天然蒽醌例如大黄素等都有羟基,所以含有酚羟基的蒽醌类化合物也可以直接用碱溶液进行抽提,再用酸使之沉淀的方法进行提取。

2·1　高速逆流色谱　袁黎明等[3]利用高速逆流色谱对传统中药大黄中的蒽醌类活性成分进行制备性分离研究,两相溶剂分离系统采用氯仿:甲醇:水=4:3·8:2,并对制备物进行薄层色谱分析,检验其中的大黄素,证实了其中的蒽醌类成分,充分说明了该方法的有效性和实用性。

在含有蒽醌类的植物如大黄中,其有效活性成分的极性分布范围广,最初的提取大多数采用乙醇,因为醇类具有较好的溶解性能。在色谱系统中固定相和移动相要同时选择。氯仿/甲醇/水具有上下两相大约相等且平衡时间短的优点,是目前应用较多的溶剂分离系统之一。此溶剂体系中,氯仿和水分别成为两相,甲醇在两者中皆有分布。当甲醇增加时,一方面减少水相的极性,同时也增加了氯仿的极性,达到同时改变待分离成分在两相中分配的目的。

结果表明:该方法能在短时间(3h)里,1次制备性地分离复杂的样品还是鲜见的。同时也将高速逆流色谱推广应用到植物化学领域,为植物中活性成分的提取和开发奠定了基础。

2·2　渗漉提取法　赵文萍等以大黄素含量为考察指标,采用L9(34)正交试验法进行了大黄提取工艺的筛选。结果表明乙醇的浓度、乙醇的用量以及浸润时间3因素对大黄总蒽醌的

提取都有显著影响。结果表明:在用8倍量55%乙醇,浸泡12h,渗漉时间9h的条件下进行大黄渗漉提取时大黄素含量最高。同时也证明了渗漉提取是制备大黄素的可取方法之一。但是这次试验仅仅以大黄素含量为指标,对大黄的渗漉条件进行了探讨,但是对于其他成分的影响没有作进一步的研究。

2·3　煎煮提取法　辛志伟等以大黄素含量为指标,选用L9(34)进行正交实验优选乌三颗粒剂中水溶性成分的提取工艺,综合考察了影响水溶性成分煎煮提取的四个因素:浸泡时间、加水量、煎煮时间和煎煮次数。得出了这样的结论:加生药材的10倍量水,浸泡60min,煎煮3次,每次煎煮60min,合并煎液,滤过。减压浓缩后,使煎液的相对密度达到1·10(60℃热测)。浓缩液喷雾干燥干膏粉加糊精制粒,湿颗粒于80℃干燥即得。

其根据何首乌等药物的成分确定采用水煎煮法来提取的,这种提取工艺为该种制剂的制备打下了很好的基础。但是对于那些含有醇溶性和挥发性油的药物不适用。

2·4　碱提酸沉法　陈琼华等综合研究中药大黄XXXI·大黄蒽醌衍生物的系统分离改进方法。其采用大黄小碎片加到20%硫酸溶液和氯仿的混合液中,在水浴中回流以水解,提取。仿提取液相继以5%碳酸氢钾溶液,5%氢氧化钾溶液提取。提取液分别以盐酸酸化,即可分离得到大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚混合物的黄色沉淀物,再经过结晶

即得较纯的产品。(在此提取过程中用5%碳酸氢钾溶液分离大黄酸时,有时会混入部分大黄素,量少时结晶即可;量大时利用它们的溶解度不同进行分离,如以冰醋酸结晶时,大黄酸溶解度较低。在以5%碳酸钠溶液提取大黄素时,也会混入一定量的芦荟大黄素,可以将沉淀溶于氯仿中静置过夜,其中芦荟大黄素难溶于氯仿)。

结果表明:此方法步骤简单,可以达到系统分离的目的,可以应用于实际的生产中。但是在分离大黄酸、大黄素和大黄酚等提取物时,却很难得到纯品。

3　分离方法

3·1　pH梯度萃取法　利用天然蒽醌呈现的酸性不同这一特性,用不同碱度的水溶液进行萃取,可以达到分离的目的。一般先将材料用有机溶剂(氯仿、乙醚等)提取,然后用不同pH的碱溶液进行萃取,通常用的碱溶液为5%碳酸氢钠、5%碳酸钠、1%和5%氢氧化钠溶液,但是大黄素仅可用5%碳酸钠、1%和5%氢氧化钠溶液。溶于碱溶液的蒽醌(如大黄素、大黄酸等),再分别进行酸化使之析出,再用有机溶剂萃取。有机溶剂层经水洗、干燥后,蒸干即得粗蒽醌,然后进行重结晶精制。

3·2　色谱分离法　对蒽醌类混合物的进一步分离一般采用柱色谱分离法。由于氧化铝对羟基蒽醌的吸附能力太强,所以一般不采用。常用的吸附剂有磷酸氢钙、硅胶和聚酰胺粉等,以硅胶为多。

3·2·1　碳酸氢钙色谱法　将蒽醌混合物溶于氯仿、丙酮等有机溶剂,然后拌在少量的磷酸氢钙上,晒干后,加在预先装好的磷酸氢钙柱(干装)上,用苯、氯仿等有机溶剂展开、洗脱。磷酸氢钙的pH值不同,其吸附能力就不同。因此,须要预先用磷酸调节到所需要的酸度。

3·2·2　硅胶色谱法　硅胶是最常用的吸附剂之一,通常也在硅胶中加入少量草酸或柠檬酸,来抑制蒽醌的解离。洗脱剂常采用苯、乙酸乙酯和甲醇,以及它们的混合溶剂。

3·2·3　聚酰胺色谱法　聚酰胺通常对羟基蒽醌的分离效果较好。

3·2·4　聚酰胺和葡聚糖凝胶色谱法　对于蒽醌苷,一般采用聚酰胺和葡聚糖凝胶色谱法进行分离。聚酰胺色谱是利用蒽醌的羟基与聚酰胺形成的氢键的强弱程度差异来进行分离的。

4　测定方法

测定方法有极谱法、紫外分光光度法、纸层析-分光光度法、薄层层析-分光光度法、比色法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、纸色谱法、荧光法等。

4·1　高效液相色谱法　赵仁邦利用高效液相色谱法准确测定了何首乌中大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的含量。其采用70%甲醇超声提取浓缩后,用氯仿萃取分离出游离和结合型的蒽醌,得到定量用试液。在439nm检测波长下,以甲醇:异丙醇:水=80:10:10(磷酸调节pH为3·0)为流动相,C18为固定相,采用HPLC法测定各种成分的含量。经过实验证明,该方法较传统的比色法等精密度更高,结果更准确可靠,产品的回收率高。

4·2　分光光度法　孙小梅等对大黄素的分光光度测定及其应用进行了研究。结果证明了光度法成相容易,分相迅速,操作简便,盐用量低,无毒性并且能得到高纯度的产品—大黄素,实际应用前景广阔。实验还发现,大黄素在NaOH溶液中的平衡是可逆的,溶液中pH的变化,导致共轭环上-OH的离解。当NaOH过量时,大黄素结构中蒽醌上3个羟基完全质子化,加上共轭环上有甲基的推电子作用,共轭体系内电子云流动增加。电子跃迁所需能量降低,吸收光谱红移,而且最大吸收波长稳定在530nm。当提高酸度,-O-得质子,溶液又恢复至黄色,反应前后,大黄素结构未发生变化。根据这一原理建立了一种光度分析大黄素的新方法—Tween80-(NH4)2SO4液-固萃取体系。

4·3　高效薄层光密度法　库尔班江[11]在硅胶高效薄层色谱板上利用高效薄层光密度法测定了牛黄解毒丸中大黄素的含量。其经过硅胶薄层层析在展开剂甲苯—乙酸乙酯—甲酸(15:2:1)下,可以使大黄素斑点清晰完整,与其他成分的斑点分辨显著,并且在甲醇—氯仿(1:1)混合溶剂中得到游离的大黄素。结果证明该方法具有简便、快速,重现性好,回收率高,高效薄层色板板间误差小,精密度高,测定结果准确可靠的优点。

4·4　反相高效液相色谱法　张丹等利用反相高效液相色谱法测定了大黄药材中游离及结合型蒽醌类衍生物的含量。

其采用的色谱条件为:色谱柱Hypersil C18柱(250mm*4·6mmi·d·,10μm),流动相为甲醇-乙腈-水(3:5:2,磷酸调pH2·8),流速为1·0ml/min,柱温为25℃,检测波长为225nm。经过实验证明此种方法简便、快速、准确,可以用于大黄药材及其制剂的质量评定。但是对于其他的药材是否适用,还需要进一步验证。

5　生物活性

5·1　抑制胰酶作用　大黄素能抑制胰酶的分泌,对于急性胰腺炎发病有关的5种胰酶具有明显的抑制作用。

5·2　抑菌、抗炎及免疫调节作用　大黄素抗菌谱广,抗菌活性强,对肺炎双球菌、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、炭疽杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌及多种常见的致病性真菌均有较强的抗菌作用,并具有抗炎活性。大黄素还能抑制人肾小球系膜细胞1L-1β、1l-6及TNL-Α的生成。

5·3　抗氧化及清除氧自由基　大黄素还具有清除氧自由基的作用。大黄素对大鼠的脑匀浆脂质过氧化引起的极微弱化学发光均有猝灭作用,构效关系提示大黄素临位与中位羟基取代是该类物质抗氧化所必需的。

5·4　肾保护作用　有学者探讨了大黄素对狼疮性肾炎(LN)肾间质成纤维细胞增殖、凋亡的影响。结果证实大黄素能有效地抑制人肾成纤维细胞的分裂增殖和促其凋亡的作用,从而达到减轻LN肾间质纤维化病变,改善LN的预后。Liu等通过细胞培养的方法证实大黄素能抑制人狼疮性肾炎纤维母细胞的增殖,通过上调纤维母细胞c-myc基因表达,促进细胞凋亡,认为大黄素有助于改善狼疮性肾炎患者的预后。Ning等用细胞培养的方法证实,大黄素是通过抑制DNA合酶及延缓细胞周期来抑制人肾纤维母细胞增殖,为临床应用提供了实验基础。曾有学者利用大黄牡蛎煎来治疗慢性肾功能衰竭22例,有3例出现显著疗效;有14例出现好转;另有5例无效。临床与实验研究表明,大黄及大黄各种复方制剂治疗慢性肾功能衰竭(CFR)疗效肯定。机制涉及多个环节包括改善氮质血症、抑制肾脏代偿性肥大和高代谢状态等。作为长期理想的治疗CFR药物的前景十分广阔,药理及临床试验表明大黄素有望成为一种治疗慢性肾衰竭的治疗新药。

5·5　对循环系统的作用　大黄素对多种血管有舒张作用,能抑制5-羟基胺对血管的收缩作用,协同乙酰胆碱的舒张作用,其舒张作用与自由基或氢过氧化及cGMP增加有关。大黄素还可抑制血小板聚集,改善微循环,降低血液浓度。

5·6　其他作用　大黄素尚有泻下、利胆、抗癌、抗肿瘤及治疗急性胰腺炎大鼠等作用。

6　研究展望

随着对大黄素的进一步研究,大黄素良好的提取分离、测定及其临床应用前景将逐渐显露。对于大黄素这种用途广泛的天然有效成分,其开发具有广阔的实际应用发展前景;这些方法也必将促进植物活性成分的开发和传统中草药的现代化研究。