白藜芦醇(resveratro1)是一种含有芪类结构的 非黄酮类多酚化合物。化学名称为3，4，5一三羟基 一1，2一二苯乙烯。是植物在受到真菌感染、紫外 照射或病理状况下产生的一种植物补体。它主要存 在于虎杖、葡萄、花生、桑椹、松树等70多种植物中， 在葡萄中的含量尤为丰富l1j。早期研究表明白藜芦 醇具有抗炎、抗菌、抗氧化、抑制血小板聚集、降血 脂、保肝、镇咳、平喘、免疫调节等广泛的生物学活 性。近年来，随着对白藜芦醇研究的深入，发现白白藜芦醇具有抗肿瘤的功效，且表现为对肿瘤的起始、 促进和进展3个阶段均有抑制作用 J。我们对白藜芦醇对人舌癌细胞系Tca体外的作用进行研究。

 1 材料与方法

 1．1 材料

 舌癌细胞系Tca(上海细胞所，本实验室冻存)； 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；H — DMEM培养基(Gibicol公司)；胰蛋白酶、MTI’(华 美公司)；DMSO(Sigma公司，美国)。白藜芦醇(Sig． ma公司，纯度大于99．5％)。

 白藜芦醇的配制：白藜芦醇由二甲基亚砜 (DMSO)助溶，分装，一20qC避光保存备用。用时用 H—DMEM培养液稀释，DMSO控制在体积分数小于 0．1％(该体积分数的DMSO对细胞没有影响)。

 1．2 方法

 1．2．1 细胞培养人舌癌细胞Tca在5％ C02、37 ℃条件下，用含10％胎牛血清、100 U／mL青霉素、 100~g／mL链霉素的H—DMEM培养液传代培养，培养至70％ 80％融合时，用0．25％胰酶消化传代继 续培养。

 1．2．2 MTI"法测定含白藜芦醇对舌癌细胞的生长 抑制将对数生长期的Tca细胞胰酶消化，制成单 细胞悬液，调整细胞浓度，以1×lO4／：fL接种于96孔 板，5％ C02、37 oC条件下培养24 h后，实验组分别 加入0、25、50、100、200和400 ttmol／L(最终浓度)的 白藜芦醇，对照组加入相同体积的DMSO，每组均设 置3个复孔。分别培养48、72 h后加MTF液(5 mg／ mL)20 L／孔，孵育4 h。加DMSO 150 L／孔，振荡 5 min，显色。用酶标仪在波长490 nln下读取吸光 度，计算细胞生存率l_3 J。细胞生存率=(实验组吸光 度平均值／对照组吸光度平均值)×100％。

 1．2．3 平板克隆形成实验根据MTF结果，白藜 芦醇组选择含有75 tanol／L(最终浓度)的H—DMEM 培养液，对照组细胞用含有相同体积DMSO的H— DMEM培养液。取对数生长期的Tca细胞，用 0．25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞悬液，用含 10％胎牛血清的H—DMEM培养液把细胞重悬，细 胞计数，调整细胞浓度，以150个细胞／皿接种于直 径为60 mm的培养皿，每组接种3个平皿。24 h后， 将实验组细胞培养液更换为含有75 pmol／L白藜芦醇(最终浓度)的H—DMEM培养液；对照组更换为 含有相同体积DMSO的H—DMEM培养液，37℃、 5％C02饱和湿度环境下，静止培养21 d后，弃去培 养液，用PBS(0．01 mol／L，pH7．4)浸洗2次，加入纯 甲醇5 ml于室温下固定15 min，弃去固定液，加入2 rTll姬姆萨应用液染色20 min。自来水缓慢洗去染 液，空气中干燥，将培养皿倒置并叠加一张带网格的 透明胶片，用肉眼计细胞克隆数。克隆形成率=克 隆数／150×100％。

 1．2．4 细胞周期检测根据MTI"结果，白藜芦醇组选择含有100 ta’nol／L(最终浓度)的H—DMEM培 养液，对照组细胞用含有相同体积DMSO的H— DMEM培养液，培养时间为48 h。用0．25％胰蛋白 酶消化细胞，1 000 rpm离心5 min，收集细胞沉淀(注 意：将培养液中悬浮的细胞一同收集)，PBS洗涤，离 心，将细胞沉淀用75％乙醇重悬，流式细胞仪检测 细胞周期，相同实验重复3次。

 1．2．5 细胞凋亡检测根据MTF结果，白藜芦醇组选择含有100／nnol／L(最终浓度)的H—DMEM培 养液，对照组细胞用含有相同体积DMSO的H— DMEM培养液，培养时间为48 h，胰酶消化，收集细 胞沉淀。按照Annexin V／PI双标试剂盒说明，用双 蒸水1：4稀释结合缓冲液，PBS洗涤样品细胞后，以稀释的结合缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度为2 ×1 055×105／mL。取195 ttL细胞悬液，加入5 Armexin V混匀，室温反应10 min，PBS洗涤细胞一 次，再以190 gL稀释的结合缓冲液重悬，加lO血 (20／zg／mL)PI，用流式细胞仪分析。每样本收集1× 104个细胞荧光信号，采用Cellquest软件分析结果。

 将Tca细胞接种24孔板，每孔105个细胞，分别 用含有100 tmaol／L(最终浓度)白藜芦醇和相同体积 DMSO的H—DMEM培养液培养细胞48 h，而后用 Hoechst33258荧光染料染色，荧光显微镜下观察细 胞核形态。

 1．3 统计学方法

 所得数据采用SPSS8．0统计软件行成组t检 验，P<0．05为显著性差异。

 2 结果

 2．1 MTF实验

 用终浓度分别为0、25、50、100、200和400 umol／ L的白藜芦醇培养细胞48、72 h后，随着药物浓度的 增加，白藜芦醇对细胞生长的抑制作用逐渐增强，显 示白藜芦醇对细胞的抑制作用呈明显的剂量一时间 依赖关系。利用作图法测得加药48、72 h后白藜芦 醇对Tea细胞的半数抑制浓度(IC5o)分别约为100 t~mol／L和75 t~mol／L。(图1)

 2．2 平板克隆形成实验

 分别用含有75 tm~ol／L白藜芦醇(最终浓度)的 H—DMEM培养液和含有相同体积DMSO的H— DMEM培养液培养细胞，21 d后，加药组细胞的克隆 形成率明显低于对照组(图2，P<0．05)。

 2．3 细胞周期检测

 流式细胞仪检测结果显示，加药组相当于对照 组而言，G1期细胞明显增多(图3，P<0．05)。

 2 ． 4 流式细胞仪检测细胞凋亡

 凋亡早期， 细胞内膜的磷脂酰丝氨酸移位到细 胞外膜， 荧光标记的A r m e x i n V 极易与细胞外膜的磷 脂酰丝氨酸结合从而使其染色。T c a 细胞经10 0 > m o l ／L 白藜芦醇处理4 8 h 后， 细胞凋亡率高于对照 组( n = 3 ， P < 0 ． 0 5 ) ， 其中加药组细胞凋亡率为 ( 8 0 ． 3 ± 5 ． 3 ) ％ ；对照组为( 14 ． 1 ± 2 ． 6 ) ％ 。

 经H o e e h s t 3 3 2 5 8 荧光染料染色， 荧光显微镜下， 正常细胞染色质均匀、核形态规则。10 0 tm l o l ／L 白藜芦醇作用4 8 h 后， 可见凋亡细胞，呈现细胞体积缩小、 核固缩、染色质凝集、碎裂等典型的凋亡特征( 图4 ) 。

 3 讨论

 19 9 7 年， J a n g 等l_2 J 较系统地报道了白藜芦醇的抗 肿瘤作用后使其受到了人们的广泛关注。现有的文 献表明白藜芦醇可拮抗消化、血液、呼吸、生殖等多个系统来源的多种肿瘤细胞的增殖， 对肿瘤细胞的 发生、促进、发展3 个阶段均有抑制作用。

 M 1 Tr 法检测药物对肿瘤细胞的抑制作用具有简 便、快速、灵敏度高、重复性好等优点， 现已广泛应用 于抗癌药物的临床前研究中。本实验M T I ’ 法显示 随着药物浓度的增加和药物作用的时间延长， 其对 细胞的抑制作用也逐渐增强， 呈明显的剂量一时问 依赖关系。当药物浓度达到4 0 0 ／x m o l ／L 时， 4 8 h 后， 细胞基本全部死亡。利用作图法测得作用4 8 h 和 7 2 h 后， I c 钔值约为1 0 0 t~ m o l ／L 和7 5 ~ m o l ／L 。

 文献报道， 白藜芦醇对细胞周期所发挥的作用 主要针对其中的两个环节， 即G 1 一S 和S — G 2 。A h — m a d 等一J 报道白藜芦醇能以剂量和时间依赖方式诱 导细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶( C D K ) 抑制蛋白 p 2 1 W A F 2 1 的产生， 并能减少细胞周期蛋白( c y c l i n ) D l 、D 2 、E 和C D K 2 、C D K 4 、C D K 6 的蛋白表达， 进而造 成人表皮癌A 4 3 1 细胞的G l 期停顿， 使细胞不能完 成从G l 期至S 期的转化， 并认为这一过程是不可逆 的，将最终导致细胞凋亡。还有研究则认为白藜芦醇还能通过阻断S 期和G 2 期的进展而抑制牛肺动 脉内皮细胞增殖。P a r k 等则进一步发现白藜芦醇 在低浓度时能诱导S 期停顿， 浓度过高则反而无此 活性， 同时还认为这一阻断过程是可逆的。本实验 的结果显示， 白藜芦醇与T e a 细胞作用4 8 h 后， G 1 期细胞的比例明显s ~ Dri ， 出现G l 期阻滞， 这与文献 报道的一致。

 细胞凋亡是细胞自身调节的主动性死亡过程， 不引起炎症反应， 机体不会因此发生不良反应， 因而细胞凋亡是肿瘤治疗研究的一个重要领域。白藜芦醇以诱导肿瘤细胞凋亡的方式抗肿瘤无疑显示了其 在肿瘤治疗中的潜在应用价值。在白藜芦醇引起细 胞凋亡的研究中， 1 9 9 8 年， C 16 r n e n t 等首先报道了白藜芦醇能通过C D 9 5 一C D 9 5 L 途径( 即F a s — F a s L 途径) 诱导H L 一6 0 细胞株和人乳腺癌细胞株T 4 7 D 发生凋亡， 而对正常人外周血淋巴细胞则无此作用。 此后，许多研究小组对其诱导肿瘤细胞凋亡的机制 进行了研究， 结果显示， 白藜芦醇可能对凋亡发生过 程中的多个环节均有作用。采用不同的肿瘤细胞株 可能在一定程度上影响实验结果， 或者说对于不同 的肿瘤细胞， 白藜芦醇诱导凋亡的机制可能大不相同。本实验的结果显示， T e a 细胞经1 0 0 tl m o l／L 白藜芦醇处理4 8 h 后， 细胞凋亡率高于对照组。