【摘要】　目的　探讨大鼠肠缺血/再灌注(I/R)损伤致肠黏膜损害的机制及大黄素的保护作用。方法将30只雄性Wistar大鼠随机分成假手术组、肠缺血45 min再灌注6 h模型组和大黄素预处理组。用无创伤动脉夹夹闭大鼠肠系膜上动脉制备肠I/R模型;假手术组仅开腹不钳夹血管。大黄素预处理组在术前30 min经股静脉注入大黄素(2.5 mg/kg),假手术组和模型组分别注入等量生理盐水。在缺血45 min再灌注6 h后,各组分别经下腔静脉采血,然后处死大鼠取肠系膜淋巴组织及小肠组织标本。分别检测各组血清肠脂肪酸结合蛋白(IFABP)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;小肠组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)活性;血液及肠系膜淋巴组织细菌移位率;并进行小肠组织病理学观察。结果　与模型组比较,大黄素预处理组IFABP、NO、TNF-α、MDA、MPO水平均明显降低(P均<0.01),SOD活性明显升高(P<0.01),肠系膜淋巴组织细菌移位率显著降低(血液2/10只比8/10只,肠系膜淋巴组织3/10只比8/10只,P均<0.05);病理损害明显减轻。结论　大黄素可减少TNF-α、NO释放,抑制过度炎症反应,减轻中性粒细胞聚集及活化,减少大鼠氧自由基的生成,对大鼠肠I/R损伤具有保护作用。

【关键词】　缺血/再灌注损伤,肠;大黄素;炎症介质

肠缺血/再灌注(I/R)可造成肠黏膜屏障功能障碍、肠通透性增加、肠道内细菌和内毒素移位入血,引发失控的炎症反应和脓毒症,进一步可发展为多器官功能障碍综合征(MODS),甚至多器官功能衰竭(MOF)。本研究拟采用大鼠肠I/R模型,探讨大黄素对肠I/R损害的保护作用及机制。

1　材料与方法

1.1　动物模型的制备和分组:健康雄性Wistar大鼠30只,按随机数字表法分成假手术组(A组)、肠缺血45 min再灌注6 h模型组(B组)、大黄素预处理组(C组),每组10只。采用肠系膜上动脉(SMA)夹闭/松夹方式制备肠I/R模型。术前30 min,C组经右下肢股静脉注入大黄素2.5 mg/kg,A组和B组则分别注入等量生理盐水。用质量分数为1%的戊巴比妥(5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠,上腹部正中切口进腹,钳夹SMA根部2 min,待确定SMA血流被完全阻断后(肠壁色泽苍白,系膜血管无搏动)缝合伤口,45 min后开腹,打开动脉夹,恢复SMA血流供应;B组和C组分别于再灌注6 h后取标本。A组仅开腹分离SMA但不钳夹。

1.2　标本采集及处理:再灌注6 h后,从下腔静脉取血5～6 ml,1 ml送细菌培养,剩余血立即离心20 min后分离血清, 80℃冰箱保存,用于生化指标含量的测定。处死大鼠后取距回盲部5 cm处小肠组织,用生理盐水清洗,冰箱中保存。称小肠组织制成体积分数为10%的匀浆,离心10 min后取上清液置冰箱中保存,用于测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)含量。

1.2.1　细菌培养:①血液细菌培养:按照常规进行。②肠系膜淋巴组织细菌培养:严格无菌条件下切取大鼠肠系膜淋巴组织,匀浆后置于营养肉汤内增菌,放置于35℃温箱中培养24～48 h,根据细菌生长的特点、菌落和生化反应鉴定各种细菌。

1.2.2　检测指标与方法:①血清肠脂肪酸结合蛋白(IFABP)测定:采用酶联免疫吸附实验,严格按试剂盒说明书操作,结果以ng/L表示,试剂盒购自美国MERKET公司。②血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度测定:采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA),结果以ng/L表示,试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。③血清一氧化氮(NO)浓度测定:采用硝酸还原法测定NO-2/NO-3,于波长550 nm处测吸光度(A)值,按公式计算NO浓度,结果以μmol/L表示,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。④小肠组织MDA测定:采用硫代巴比妥酸显色法,于波长532 nm处测A值,按公式计算,结果以每毫克蛋白组织中的含量(nmol/mg)表示,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。⑤小肠组织SOD活性测定:采用黄嘌呤氧化酶细胞色素C法测定,按照试剂盒说明书操作,于波长550 nm处测A值,结果以U/mg表示,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。⑥小肠组织MPO测定:采用邻连茴香胺显色法测定,于波长460nm处测A值,按公式计算每克湿组织MPO活性(U/g)。

1.2.3　病理学检查:用体积分数为10%的甲醛固定小肠组织,苏木素-伊红(HE)染色后光镜观察。

1.3　统计学处理:结果以均数±标准差(x±s)表示,统计学处理采用方差分析,细菌移位率用多个样本比较的秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1　血清IFABP、TNF-α、NO浓度(表1):肠缺血45 min再灌注6 h后,血清IFABP、TNF-α、NO含量均较A组显著增加(P均<0.01);C组上述指标则均较B组显著降低(P均<0.01)。

2.2　小肠组织MDA、SOD、MPO水平(表2):肠缺血45 min再灌注6 h后,小肠组织MDA含量和MPO活性均显著增加(P均<0.01),SOD活性则显著降低(P<0.01);与B组比较,C组小肠组织MDA含量和MPO活性均显著降低(P均<0.01),而SOD活性则显著增加(P<0.01)。

2.3　大鼠肠系膜淋巴组织及血液细菌培养阳性结果比较:各组大鼠血液及肠系膜淋巴组织培养出的细菌菌种包括大肠埃希菌、克雷伯杆菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、液化沙雷菌等,以大肠埃希菌、克雷伯杆菌、变形杆菌为主。各组大鼠细菌培养阳性结果:血培养A组为0,B组为8只,C组为2只,B、C两组比较差异有统计学意义(P<0.05);肠系膜淋巴组织A组为1只,B组为8只,C组为3只,C组细菌移位率低于B组(P<0.05)。

2.4　病理学观察:①大体观察:A组无腹水,小肠无明显改变;B组有较多的淡黄色腹水,小肠充血水肿明显;C组有少量淡黄色腹水,小肠轻微充血水肿。②光镜观察:A组肠壁形态结构正常,黏膜层绒毛完整,呈指状突起;黏膜下层、肌层、浆膜层结构正常;B组肠壁坏死较严重,累及整个黏膜层,有广泛充血、炎性细胞浸润;C组肠壁坏死较轻,只发生在绒毛顶端,绒毛外形尚存,黏膜下层有轻度充血水肿。

3　讨　论

目前认为,肠黏膜低灌注、中性粒细胞聚集激活、氧自由基损伤及细胞因子过度释放为肠黏膜的主要致伤因素。胃肠道是单核/巨噬细胞产生TNF-α的最主要靶器官之一,肠I/R可致小肠组织TNF-αmRNA表达明显增高。肠I/R损伤过程中,机体单核/巨噬细胞系统被过度激活,释放大量TNF-α,作为始发因子诱导白细胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)基因表达,引起“级联反应”并造成炎症介质的失控性释放,致使肠组织损伤,与肝、肺组织相比,小肠表达TNF-α最早,幅度也最大。       、

NO作为一种活性氧自由基,不仅在细胞间和细胞内信号传递过程中起关键作用,同时也是调节全身免疫防御反应的重要介质,并且与器官功能损害密切相关。Banan等研究发现,肠I/R时,肠组织诱生型一氧化氮合酶(iNOS)信使RNA表达增

强,iNOS活性增强,血浆NO升高;NO可使肠上皮细胞ATP耗竭及其紧密连接膨胀,致肠黏膜屏障功能降低。MPO存在于中性粒细胞溶酶体中,组织MPO活性增高提示中性粒细胞在组织内聚集程度增加。当中性粒细胞过度激活时,中性粒细胞在跨血管内皮细胞游走、浸润过程中释放大量细胞毒性物质,如弹性蛋白酶、胶原酶、蛋白水解酶等,直接导致组织损伤。聚集的中性粒细胞机械堵塞毛细血管致

微循环障碍,使血流阻力增加,血流减慢,血黏度增加,加重组织缺血、缺氧,并导致微血栓形成,加重肠组织损害。MDA含量显著增高,提示氧自由基对肠黏膜的损伤增加,肠组织SOD活性降低可间接反映清除氧自由基能力下降。二者联合检测结果表明肠组织遭受氧自由基所致的严重损伤。

研究表明,大黄的主要有效成分大黄素在治疗急性胰腺炎、多器官功能障碍以及肝、脑I/R损伤具有器官保护作用。李新宇等〔10〕在大黄对肠I/R所致肺损伤的研究中发现,大黄能保护肠道功能,防治肠I/R损伤致肺损伤,这种作用可能是通过抑制TNF和内源性NO等炎症介质的释放来实现的。中医认为大黄的功用为通里攻下、清热利胆;现代医学研究发现,大黄具有改善微循环、抗凝、抗血栓、抑酶、抑菌、导泻、解除奥迪括约肌痉挛等作用,其机制与促进细胞凋亡、抑制核转录因子-κB (NF-κB)活化,降低细胞因子表达有关〔7 8〕。本实验发现,C组TNF-α、NO和MDA含量较B组明显降低,MPO和SOD活性明显升高,故认为大黄素有保护肠黏膜损害的作用。其机制可能为:抑制TNF-α的生成及大量NO释放,减少氧自由基的生成及中性粒细胞聚集与活化。实验结果还显示,C组早期肠黏膜屏障损伤预警指标IFABP明显降低,肠系膜淋巴组织细菌移位率亦明显低于B组,肠黏膜损伤病理改变减轻,进一步表明了大黄对肠I/R所致肠黏膜损伤的保护作用。