高效液相色谱法测定山楂中的苦杏仁甙

发布时间:2013-10-18 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2191

摘要:建立了从山楂中提取苦杏仁甙的方法,样品先用石油醚脱脂,然后用甲醇进行索氏提取。用高效液相色谱法定量测定了山楂中的苦杏仁甙,色谱条件如下:反相C18柱,流动相为15%的甲醇水溶液,检测波长为215nm。测定了含不同比例山楂籽的山楂样品,结果表明含山楂籽比例高的山楂样品中苦杏仁甙的含量高,且山楂粗粒样品中苦杏仁甙的提取量比粉末样品的提取量高。

关键词:高效液相色谱法;索氏提取;超声提取;苦杏仁甙;山楂

苦杏仁甙(amygdalin,化学名为苯羟基乙氰-β-D-葡萄糖-6-β-D-葡萄糖甙,结构式见图1)属于芳香族甙,是维生素B17的主要成分,它广泛存在于蔷薇科植物的种子中。在苦杏仁甙酶的作用下苦杏仁甙将分解产生氢氰酸,对呼吸中枢产生一定的抑制作用,起到镇咳平喘的功效。尽管少量的氢氰酸能止咳,但在人体内积累到一定量后氢氰酸会和细胞线粒体中的氧化酶反应而抑制酶的活性,进而抑制组织细胞的呼吸作用而致人死亡。因此必须限定苦杏仁甙在食物、药物中的含量。

　检测苦杏仁甙的方法主要是高效液相色谱法(HPLC),其他的检测方法虽然也有报道,如气相色谱法、毛细管电泳法等等,但HPLC以其分离效率高、分析速度快而成为最通用的方法。HPLC方法常选用反相C18柱作为分离柱,不同浓度的甲醇(或乙腈)水溶液作为流动相,采用紫外检测。山楂为蔷薇科植物山楂红(Crataegus pinnatifida Bge. var.majorN. E. Br. )或野山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)的干燥成熟果实,其主要成分包括有机酸和黄酮类化合物等,对这些成分的研究已有不少报道。日本等国家已经开始对从中国进口的山楂提出测定苦杏仁甙含量的要求,但是现在并未发现关于山楂中苦杏仁甙检测方法的报道。本文的研究目的就是优化山楂中苦杏仁甙的提取方法,建立山楂中苦杏仁甙的HPLC定量分析方法。本文用石油醚对山楂进行脱脂后用甲醇提取苦杏仁甙,并用HPLC对山楂中的苦杏仁甙含量进行检测。

1　实验部分

1.1　仪器及色谱条件

美国惠普公司HP1100系列高效液相色谱仪,由四元梯度泵、二极管阵列检测器(DAD)、HP化学工作站和在线脱气装置组成。色谱柱为Agilent C18柱(250mm×4·6mm i·d·,5μm )。流动相为15% (体积分数)的甲醇水溶液,流速为0·8mL/m in,紫外检测波长为215nm,柱温为30℃,进样量为20μL。所有样品均经0·45μm滤膜过滤后进样。

1.2　样品与试剂

　山楂样品由天津双勋堂药业公司提供,苦杏仁甙标准品购自北京化学试剂公司。甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

1.3　样品处理

　　实验中所用山楂样品共5种:山楂粉、含7%(质量分数,下同)山楂籽的山楂粉(在山楂粉中添加7%山楂籽粉末,下同)、含20%山楂籽的山楂粉、山楂粗粒(粉碎时过筛出来的粗颗粒)和含24%粗粒的山楂粉(在山楂粉中添加24%过筛出来的粗颗粒)。取5种山楂样品各1g,浸泡在10mL石油醚中,超声提取15m in。过滤后将残渣用100mL甲醇在70℃水浴条件下索氏提取5h。提取液用甲醇定容至100mL。

2　结果与讨论

2.1　苦杏仁甙的HPLC分析方法的建立

　利用C18作固定相,不同体积比的甲醇和水作流动相。当甲醇和水的体积比为15∶85时,苦杏仁甙和其他成分基本可以达到基线分离(见图2)。苦杏仁甙在215nm波长下有最大紫外吸收,故紫外检测波长选用215nm。

　标准曲线:将苦杏仁甙标准品溶于甲醇中,并稀释成系列浓度的标准溶液。以峰面积对相应的苦杏仁甙浓度做标准曲线,得标准曲线的线性回归方程为A=1.239 1C+1.772 9,r2=0.998 6,其中A为峰面积,C为质量浓度(mg/L)。结果表明,苦杏仁甙质量浓度在1~20mg/L时,其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。将最低浓度的标准溶液逐级稀释进样,当信噪比(S /N)为3时的浓度即为检出限。测得苦杏仁甙的检出限为0·2mg/L。

　精密度实验:取质量浓度分别为5,10,15mg/L的苦杏仁甙标准液,分别重复进样5次,测得峰面积,计算其峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0·71%,0·49%和0·88%,说明色谱分析方法具有良好的精密度。

　稳定性实验:取同一份样品溶液,于室温下放置,分别在0,2,4,6,8h取样,在相同色谱条件下测

定峰面积。苦杏仁甙的峰面积基本保持不变,相对标准偏差为0·40%。说明被测组分在本实验条件下稳定。

　加样回收率:取已知含量的纯山楂粉末样品5份,分别加入0·100 0mg的苦杏仁甙标准品,按样品测定方法处理和测定。计算加样回收率,结果见表1。由表1数据计算得苦杏仁甙的平均回收率为103·4%,RSD为1·05%。说明本方法可靠。

2.2　山楂中苦杏仁甙提取方法的优化

　　苦杏仁甙易溶于甲醇,所以选用甲醇作为提取剂。甄攀等[8]用甲醇从郁李中提取苦杏仁甙并测定了含量,马辰等[9]也用甲醇从苦杏仁中提取苦杏仁甙并进行了含量测定。但甲醇能将一些色素和酯类大分子同时提取出来,在分析过程中污染色谱柱,从而降低柱效,使苦杏仁甙难以和其他物质分离。石油醚是一种非极性溶剂,包括色素和酯类在内的亲脂性物质易溶于其中,而苦杏仁甙难溶于石油醚。所以首先用石油醚除去这些干扰成分。实验表明在

石油醚相中检测不到苦杏仁甙,说明苦杏仁甙几乎未被石油醚萃取出来。

索氏提取是中药有效成分提取的最常用方法,由于它的溶剂是循环使用的,所以可以更有效地提取中药的有效成分。选择70℃的水浴条件是因为温度太低会使溶剂的循环减慢,而温度太高则导致苦杏仁甙的分解。图3是不同提取时间(2,3,4,5,6和7h)和对应的苦杏仁甙提取量(提取的苦杏仁甙质量与原药材粉末质量之比,下文的“苦杏仁甙的含量”也用此表示)的曲线,从图3可以看出5h可以达到提取平衡。

2.3　不同样品形态的山楂中苦杏仁甙的含量

　　表2列出了含不同量山楂籽的山楂粉末和不同形态的山楂中苦杏仁甙的含量。可以看出,随着山楂籽含量的增加苦杏仁甙的含量也在增加。由此可以推断出苦杏仁甙在山楂籽中的含量较高。车凤斌也曾报道过苦杏仁甙广泛存在于杏、桃、李子、苹果、山楂等多种蔷薇科植物籽和苦扁桃种子中,而且随着粗粒含量的增加测得的苦杏仁甙的含量也在增加。由此可以推断出用山楂粗粒提取苦杏仁甙比用山楂粉提取的量要大。Hwang等曾比较了不同形态杏仁中提取出的苦杏仁甙的量,也发现了用粗粒提取时苦杏仁甙的量比用粉末提取的量要高原因是苦杏仁甙在与之共存的苦杏仁甙酶(emulsin)的作用下水解,山楂粉末的比表面积大,与苦杏仁甙酶接触充分,促进了苦杏仁甙的水解,造成测得的苦杏仁甙的含量比粗粒山楂低。

3　结论

　　本文建立了一种简便可行的从山楂中提取并定量测定苦杏仁甙的方法:先用石油醚超声提取15min,然后采用索氏提取法用甲醇提取残渣5h,提取液用HPLC方法(C18柱,15%的甲醇水溶液为流动相)检测苦杏仁甙含量。本方法可以用作检测山楂中苦杏仁甙的质量控制方法。从不同样品的分析结果可以得出结论,含山楂籽量大的山楂样品中苦杏仁甙的含量高,而山楂粗粒中苦杏仁甙的提取量比粉末样品的提取量高。