摘　要:　采用高效液相色谱(HPLC)法对我国陇南地区引种的油橄榄不同部位中山楂酸的含量分布进行了系统研究,建立了油橄榄不同部位中山楂酸含量的测定方法。用KromasilC18柱(250mm×4. 6mm, 5μm),以甲醇-1. 0%醋酸水溶液(体积比88∶12)为流动相,检测波长为215 nm。结果显示,油橄榄全果中含山楂酸0. 16%,果肉中含0. 17%,橄榄叶中含0. 73%,油橄榄枝条表皮中含0. 31%,油橄榄果渣中含0. 41%,而果核和油橄榄枝条木质部中则没检出山楂酸。在含有山楂酸的各个部位中,山楂酸的平均加标回收率分别为94. 1%、93. 9%、95. 5%、92. 3%和94. 7% (n=3),相对标准偏差(RSD)分别为2. 12%、1. 85%、2. 03%、1. 69%和1. 34% (n=3);山楂酸进样量在3. 15~36. 6mg/L范围内线性良好。

关键词:　高效液相色谱法;油橄榄;山楂酸

油橄榄(Olea europaeaLinn. ),又名齐墩果,为木犀科,在《本草纲目》中就有记载,原产于西班牙、意大利和希腊,我国甘肃陇南地区也开展了规模化种植工作。山楂酸是一种齐墩果烷型五环三萜酸,主要存在于山楂油橄榄果实的蜡质表皮、油橄榄叶以及油橄榄果渣中,在枇杷叶、苹果果皮、鼠尾草等中也有存在,具有抗肿瘤、抗艾滋病毒、抗炎、抗菌、抗寄生虫、减肥和保健美容等多种生物活性。温小安等研究发现,山楂酸可显著对抗肾上腺素、葡萄糖引起的血糖升高,对抗肾上腺素引起的肝糖原降解。Ana等研究表明从油橄榄提取出的天然成分山楂酸在体外培养细胞中有明显抗氧化性能。Fernando等研究发现山楂酸能够明显抑制Bc-l 2的表达而增加Bax蛋白,又能刺激线粒体细胞色素-C的释放并激活半胱天冬氨酸酶-9和半胱天冬氨酸酶-3,显著地抑制细胞增殖并导致癌细胞凋亡,从而可以治疗结肠癌;Andrés等研究发现山楂酸能够抑制丝氨酸蛋白酶,而艾滋病病毒正是利用这种酶将自身从被感染的细胞中向外部释放,扩散至病毒感染者全身。此外山楂酸还可用于乳腺癌、皮肤癌以及其他类型肿瘤的治疗。山楂酸已经成为国内外研究热点之一,对其药理药效的研究已有很多报道。Vassiliki等通过荧光法测定了初榨橄榄油、橄榄果以及橄榄叶中的总酚类化合物;Sánchez等[13]采用LC-LC-MS法测定微波辅助提取的橄榄叶中三萜类化合物;而对油橄榄各个部位中山楂酸的含量测定的研究则不多。作者建立了山楂酸的测定方法,并首次对我国陇南地区引种的油橄榄不同部位山楂酸的分布进行了系统的研究,以期筛选合适的原料作为进一步制备山楂酸单体的来源。

1材料与方法

1.1材料与试剂

油橄榄果实、橄榄叶、橄榄枝条以及橄榄果渣均采于甘肃省陇南市武都区油橄榄种植基地;山楂酸由本实验室自制,纯度99%;甲醇,色谱纯;正己烷、无水乙醇、95%乙醇,均为分析纯;水为二次蒸馏水。

1.2仪器与设备

Agilent1100高效液相色谱仪,包括:真空脱气机,四元泵,自动进样器,恒温柱温箱,紫外检测器,HP化学工作站等,美国安捷伦公司;DHG型智能电热鼓风干燥箱,南通嘉程仪器有限公司; SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;R-201旋转蒸发仪,上海申胜生物技术有限公司;高速万能粉碎机,天津泰斯特仪器有限公司;十万分之一电子分析天平,索氏提取器等。

1.3方法

1.3.1液相色谱条件　KromasilC18色谱柱(250mm×4. 6mm, 5μm);流动相为甲醇-1. 0%醋酸水溶液(体积比88∶12);流速1. 0mL/min;检测波长215 nm;洗脱方式为等度洗脱;柱温30℃;进样方式为自动进样;进样量10μL。

1.3.2样品前处理　取部分橄榄果,用干净的刀片把果肉与果核分开,洗净果核,分别干燥。把橄榄枝条表皮与木质部剥开,分别干燥。同样干燥橄榄全果、橄榄叶及果渣。把上述干燥的各样品在高速粉碎机里粉碎成粉末,备用。

1.3.3　供试液制备　采用索氏提取法对样品进行处理,一方面节省了溶剂,另墨幽中文一方面又能够把目标成分基本提取完全,使测定值能最大程度的接近真实值。把按照1.3.2节方法所得的各样品粉末干燥至质量恒定,准确称取一定量的橄榄果实粉末、果肉粉末和橄榄果渣粉末,用滤纸包扎好放入索氏提取器内,加入适量正己烷进行加热回流脱油至基本无色,渣层干燥除净正己烷后加入适量的80%乙醇溶液进行加热回流至基本无色。橄榄叶粉末、橄榄枝条表皮、果核以及枝条木质部粉末用80%乙醇溶液直接索氏提取。把上述7种样品提取液转移至100mL容量瓶中,用80%乙醇溶液定容至刻度,备用。

1.3.4  配制对照品溶液　准确称取10mg山楂酸对照品于10mL容量瓶中,用95%乙醇溶解,超声波处理5min,定容至刻度,即得1. 0 g/L的对照品溶液,备用,其色谱图如图2所示,山楂酸的出峰时间在12min左右。

1.3.5　样品溶液的制备　取上述各样品醇提液25mL于50mL容量瓶中,用80%乙醇溶液定容至刻度,即得样品溶液,待测。

1.3.6　标准曲线的绘制　取对照品溶液2、4、6、8、10μL分别进样,按上述色谱条件测定峰面积积分值,以峰面积积分值为纵坐标,对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线:Y=357.02X+33.17, r=1. 000 0;线性范围为3. 15~36. 6mg/L。

2　结果与分析

2.1　样品预处理方式对含量检测的影响

油橄榄果肉中橄榄油的含量丰富,对于目标物的提取测定有一定的影响。实验中对比研究了用正己烷回流脱油与不脱油两种处理方式。结果表明,未进行脱油处理的样品由于油脂分子的包裹作用,使得其与提取溶剂的接触面积减小,导致目标成分山楂酸不能提取完全,从而使得检测值偏低;鉴于山楂酸在正己烷中微溶,设计了加标回收率实验。实验结果表明采用正己烷脱油预处理对目标成分的测定在误差允许范围内,符合检测要求,所以实验前对油橄榄果实、果肉以及果渣等含油丰富的样品进行了正己烷脱油处理。

2.2　精密度实验

精密吸取油橄榄果样品溶液、果肉样品溶液、橄榄叶样品溶液、橄榄枝条表皮样品溶液以及油橄榄果渣样品溶液各10μL,重复进样6次,峰面积积分值的相对标准偏差(RSD)分别为1. 21%、0. 98%、0. 97%、1. 30%和1. 05%,表明该方法精密度良好。

2.3　重现性实验

准确称取上述含有山楂酸的样品粉末各5份,按照1.3.3和1.3.5节方法制得样品溶液,分别进样,山楂酸峰面积积分值的RSD分别为3. 32%、3. 53%、2. 47%、4. 65%和4. 36%,表明该方法的重现性良好。

2.4　稳定性实验

取上述7种样品溶液,放置0、1、2、4、8、24、48、72 h,分别进样10μL,根据每个样品进样8次检测所得山楂酸峰面积积分值计算,其RSD分别为2. 02%、2. 31%、1. 89%、1. 85%、1. 76%、0. 87%和0. 99%。结果表明,样品溶液常温下在72 h内基本稳定。

2.5　不同样品中山楂酸含量分析

准确吸取各样品溶液10μL,按上述色谱条件分析检测,外标曲线法计算山楂酸的含量。结果表明,油橄榄全果中含山楂酸0. 16%,果肉中含0. 17%,橄榄叶中含0. 73%,油橄榄枝条表皮中含0. 31%,油橄榄果渣中含0. 41%,而果核和油橄榄枝条木质部中则没检出山楂酸。油橄榄果实、果渣以及油橄榄叶溶液的色谱图如图3(a~c)所示。

2.6 加标回收率实验

称取已知含量的橄榄全果粉末、橄榄果肉粉末、橄榄叶粉末、橄榄枝条表皮粉末以及橄榄果渣粉末各3份,每份3. 0 g,按照1.3.3和1.3.5节方法制得样品溶液,分别加入山楂酸对照品2mg,超声波处理使其溶解。按上述色谱条件进样测定,计算回收率。结果表明山楂酸的平均回收率分别为94. 1%、93. 9%、95. 5%、92. 3%和94. 7% (n=3), RSD分别为2. 12%、1. 85%、2. 03%、1. 69%和1. 34%。

2.7　讨论

研究表明,国产油橄榄中山楂酸的含量丰富,比西班牙产油橄榄原料含量略偏低,但性质相近且杂质较少,可作为制备高纯度山楂酸的原料。因此该项研究为我国油橄榄的开发利用、高纯度山楂酸的制备及有关抗癌药物的研制提供了可靠的实验和理论基础。

3　结论

3.1　采用HPLC法建立了油橄榄及其相关部位中山楂酸含量的测定方法,其色谱条件为:色谱柱KromasilC18柱(250mm×4. 6mm, 5μm);流动相为MeOH-1. 0%HAc水溶液(88∶12,体积比);检测波长215 nm;流速1. 0mL/min。

3.2　HPLC法测定结果显示,油橄榄全果中含山楂酸0. 16%,果肉中含0. 17%,橄榄叶中含0. 73%,油橄榄枝条表皮中含0. 31%,油橄榄果渣中含0. 41%,而果核和油橄榄枝条木质部中则没检出山楂酸。

3.3　油橄榄全果、果肉、叶、枝条表皮和果渣中山楂酸的加标回收率分别为94. 1%、93. 9%、95. 5%、92. 3%和94. 7%,相对标准偏差(RSD)分别为2. 12%、1. 85%、2. 03%、1. 69%和1. 34%。表明所建立的该测定方法可用于油橄榄及相似植物中相关部位山楂酸含量的测定。