由于植物中含有多种硫苷，且在结构上具有相似性，该类化合物的分离纯化较为困难。迄今位置，国内外对硫苷的的特性及分析方法的研究报道较多，而对硫苷的分离纯化报道较少，且没有一种统一的硫苷分离纯化工艺。本文通过理论分析，确定萝卜硫苷的分离纯化方法。

1 浸提溶剂的选择

溶剂的影响是通过溶剂的溶解度、亲和力、粘度、分子大小等各种因素综合起作用的，其对浸提率和浸提速率的影响较大。提取溶剂的选择主要根据溶剂的极性和萝卜硫苷及其共存杂质的性质来决定。一般要求选择的溶剂：能选择性地溶解萝卜硫苷，使产品纯度提高；化学性质稳定，对设备无腐蚀作用；溶剂沸点低，浓缩方便，回收容易；安全、无毒、对人体无害。目前大部分提取硫苷采用甲醇沸腾法，有效防止硫苷在含水量高的环境中发生降解，并且能够除去一些亲水性的蛋白质、多糖等杂质，但是提取率不高。由于萝卜硫苷易溶于水，可以考虑用甲醇、水混合溶剂提取。

2 初提物的分离纯化方法

目前硫苷分离纯化的方法主要有凝胶色谱法和离子交换色谱法。

（一）凝胶色谱法（Gel chromatography）：是利用某些凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异，进行分离的技术。对于硫苷的分离纯化一般选用羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20），分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反向分配的作用。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH-20对化合物还起反向分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。凝胶色谱法要求流动相流速不可太快，馏分一定要接的细，1/10或1/20个保留体积接成一馏分。

（二）离子交换色谱（Ion-exchange chromatography）：是利用离子交换剂作为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的方法。离子交换剂实际上是含有碱性基团或酸性基团的高聚物，如取代酚及氨基酚与甲醛的缩合物、磺化酶或磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸等。

离子交换剂分为两类：

(1)阳离子交换剂：呈酸性，含有-SO₃H、-CH₂SO₃H、-COOH或-OH(酚羟基)等酸性基团，具有交换阳离子的能力。

(2)阴离子交换剂：呈碱性，含有-NH₂或＝NH或-N(CH)³⁺X^—等碱性基团，具有交换阴离子的能力。

用合成的方法可以得到各种活性不同的离子交换剂，用这些离子交换剂，并同时采用不同 pH 值的溶液，可从混合物中选择性地提出各种酸、碱或盐类。根据操作技术和应用的差别，离子交换色谱一般可分为三种类型，即：淋洗色谱、置换色谱和前沿色谱。其中只有淋洗色谱才能应用于分析化学中做定量分离分析，而置换色谱则是大量性质相似元素分离制备的有效方法，前沿色谱因只有首先流出的组分可以获得部分纯的组成，所以到目前为止，研究应用也很少。

凝胶色谱法的分离效果不易控制，且馏分的收集分析步骤繁琐。硫苷分子中含有的硫酸根离子使硫苷分子具有很强的极性，故选择离子交换色谱法对初提物进行分离纯化。离子交换色谱法的关键在于固定相与洗脱剂的选择。

2.1 离子交换树脂的选择

常用于硫苷分离纯化的离子交换剂主要有三种：D315树脂、717型阴离子交换树脂和DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝胶。

1）D315树脂是一种大孔的阴离子交换树脂，分子容易深入其颗粒内部进行交换，所以对硫苷离子的交换率较高；其交换官能团为C≡N，交换能力没有季铵阳离子的强，特别是对极性小的分子或离子的交换能力不强。

2）717型是一种普通的强碱性阴离子交换树脂，其颗粒内部孔径小，使硫苷分子不容易深入到颗粒内部进行交换，而色素分子的交换率较高，其原因可能是因为色素的分子半径较小。同时由于其官能团是季铵阳离子形式，硫苷离子一旦交换上去又不容易被洗脱，不利于硫苷离子的富集。

3）DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝胶的阴离子交换特异性很强，对硫苷离子的交换率很高，是油菜籽中硫苷测定方法中规定使用的阴离子交换剂，但是价格较昂贵。

.2.2 洗脱剂的选择

阴离子交换剂常用的洗脱剂为盐或弱碱溶液，其交换能力随pH变化而变化，pH越低，交换能力越大。通常强碱性交换剂流动相的pH值应小于12，弱碱性应小于7。由于碱溶液对阴离子交换剂的亲和力较弱，须用较高浓度，而盐溶液对阴离子交换剂的亲和力较强，容易洗脱出目标物。萝卜硫苷分子中含有SO₄^2-，并常以钾盐的形式存在，所以选择合适浓度的硫酸钾溶液作为洗脱剂。

.3 萝卜硫苷的精细纯化方法

原则上通过离子交换色谱分离后的被分离组分已经具有较高纯度，但由于原料中杂质的含量较高，通过一次离子交换色谱分离无法得到纯度很高的萝卜硫苷单体。为了得到高纯度的萝卜硫苷单体，上述离子交换色谱分离后得到的目标物需要进一步的纯化。高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是目前最有效的获得单一硫苷产品的纯化方法。

4 萝卜硫苷的检测分析

目前国际上还没有统一的萝卜硫苷测定方法，最常用的硫苷分析方法是反向高效液相色谱质谱联用法（LC-MS），但是这种方法需要使用昂贵的硫酸酯酶对硫苷进行脱硫处理，并且耗时很长。

甲酸能作为 HPLC 的离子对试剂，使萝卜硫苷较好的分离。萝卜硫苷的HPLC 分析检测条件：色谱柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-AP(5μm，4.6mm×200mm)；流速：1.0mL/min；检测波长：229nm；进样量：10μL；流动相：乙腈:水=2:98，含 0.1%甲酸。萝卜硫苷色谱峰的初步质谱鉴定结果：高效液相色谱图中保留时间约为 4min 的峰为萝卜硫苷。