关键词:微量热法 绿原酸 大肠杆菌 拟菌作用 热谱曲线  上禾生物

 MICROCALORIMETRIC STUDY ON ANTIBACTERIAL ACTIVITIES OF CHLOROGENIC ACID FROM FLOS LONICERAE

 Abstract:Chlorogenic acid（CA）was extracted from Flos Lonicerae.Bacteriostasic activity of different concentrations of CA for E.coli was studied by Microcalorimetry.The relationship of thermal power and time of the Escherichia coil＇s metabolism at different concentrations of CA was determined.Logistic equation was used to calculate the growth rate constants（μ） for inhibiting bacterium.Therefore,the minimal inhibitory concentration（MIC） was confirmed.

 Key words:microcalorimetry;chlorogenic acid;Escherichia coli;metabolism of icroorganism;thermal power-time curves

 近年来，金银花为主要原料的药品具有抗病毒、消炎等疗效，被广泛应用于医药市场和临床医疗．我们从金银花中提取出 了有效成分绿原酸，用大肠杆菌做拟菌实验．这是依据细菌细胞内的各种代谢过程，都伴随着能量的转移和变化，用微量热法 可连续测量细菌代谢过程所产生的热量，得到整个代谢过程的热活性信息 J．微生物代谢热谱曲线代表着细菌代谢的特征， 反映了代谢过程中生理生化特征变化的情况．本文采用微量热法研究了金银花中有效成分绿原酸对大肠杆菌的拟菌特性，用 热活性检测仪测出不同浓度绿原酸下大肠杆菌生长代谢的热功率一时问曲线，得到了该试验条件下的最佳拟菌浓度．

 1 微量量热法对细菌的研究

 1．1 概 况

 细菌生长的热动力学研究是物理化学研究的前沿课题_2]，它用微量热法和热动力学原理来研究细菌的耐药 性．目前细菌和病毒的种类繁多，而且繁殖速度极快，一些细菌和病毒几乎能在任何药物的攻击下存活下来，就会把抗药基因 遗传给后代，随着时间的推移，就会形成具有完全抗药性的细菌．不同细菌的代谢都有自己的特性，同种细菌的代谢和试验条 件密切有关，如温度、浓度等实验条件的改变必然导致代谢过程的改变．某种药物浓度大或小都不一定最有效，何种浓度为最 适宜的拟菌浓度，具有足够灵敏度的微量热计可直接测量细菌的代谢活性，比较准确地提供耐药性的参数．通过细菌对中药 耐药性的测定，筛选药物，指导用药．

 1．2 原 理

 用热活性检测仪测定在此条件下，中药提取物绿原酸对大肠杆菌生长代谢过程的热功率——时间曲线，构建 细菌生长模型，计算出生长速率常数，并确定生长速率常数与药物抑菌浓度的定量关系：细菌生长模型． 非限制条件下细菌生长的动力学模型

 数据处理用Origin软件中l ogistic model， 方程形式为

生长速率常数Y=0时，x为最小拟菌浓度，或最佳抑菌浓度(blIC)．

 2 实验部分

 2．1 实验仪器

 使用瑞典Themud MetricAB公司制造的八通道微量热活性检测仪(3114／3236TAM Air) ]．该仪器是用空气来控 制体系温度，并拥有8个通道．其主要包括测量系统、控温系统、数据输出系统．仪器是一种灵敏度较高的热导式量热仪，主要 用于研究温度变化在5～60℃之间的反应体系，可以连续监测生物学、生物化学、化学、冶金、材料学中发生的慢反应和慢过 程．其主要的检测原理为：根据热流原理，使样品因物理变化或化学反应所产生的热迅速地流向维持在恒温的环境．每一个通 道包括两个测量筒(A为样品，B为参比)，其中有两个赛贝克热传感器，一个在样品筒下面，一个在参比筒下面．样品和它的环 境之间温差引起的热交换主要通过热流传感器，相应地在该传感器中形成一个正比于热流速度的电势信号．参比中装有与样 品热容相同的物质，两者实行孪生式对接，这样就消除了因外界温度波动产生的背景噪音．八通道微量热活性检测仪可输出 1×10 W的功率，24 h基线漂移不超过2×10～W，恒温工作范围为5～60℃，可维持±0．02℃不变，测量范围60 mW 和 600 mW两档，最大样品体积24 III1．

 八通道微量热活性检测仪测量方式主要有两种：安瓶法、滴定法．根据测量体系状态的不同，或实验过程检测要求的不同可以选择不同的测量方式．滴定法适用于在实验过程当中需要加入药品的实验，安瓶法适用于固体、半固体和液体样品；本实 验主要用安瓶法，实验温度为37℃，首先将安瓶放人灭菌台上消毒15 min，然后取一支培养基接菌并全部倒人安瓶中，封El放 人仪器中，开始记录实验，当细菌代谢的热功率—— 时间曲线回到基线时，即认为实验结束．

 2．2 试剂和中药

 乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、活性炭、金银花由曲阜中草药批发站提供，产地为临沂，为忍冬／on／zerae japonica Thunb的干燥花蕾．

 大肠杆菌由山东省卫生防疫站提供．采用牛肉膏汤液体培养基，其成分为蛋白胨2．O0 g，氯化钠2．O0 g，牛肉浸膏1．O0 g， 蒸馏水200．O0 ml，调pH值7．2～7．4，过滤后分装在洁净试管中，每支试管盛8．O0 m1．然后用l2l℃蒸汽灭菌30 min，冷却后置 冰箱备用 J．

 2．3 耐药菌培养

 将大肠杆菌用接菌环接两环到8．O0 ml培养基，在37℃下培养12 h，12 h后接菌到同样浓度的药液中在同 样条件下培养．

 3 研究内容

 3．1 中药有效成分的提取

 选用中草药金银花，对中草药的有效成分进行提取 ]，采用减压、蒸发、浓缩、分离、萃取等方法进 行纯化，从而得到所需物质绿原酸，绿原酸是含有羟基和邻二酚基的有机酸，极性与乙醇相对接近，所以含有乙醇的溶媒更易 有效的提取出绿原酸}4]．具体做法为：

 1) 称取200 g金银花，粉碎后用800 ml水热浸1．5 h，温度保持40—50℃；在同样温度下用600．00 ml水热浸1 h；用 400．00 ml水热浸O．5 h；3次滤液合并，用旋转蒸发仪浓缩至80．00 II1l毫升．分4次加入95％的乙醇150．00 ml，每次振荡洗涤 梨型瓶．将液体倒人抽滤瓶抽滤，在35℃用旋转蒸发仪蒸去乙醇(回收)

 2) 在较黏稠滤液中加入25．00 rI1l石油醚，用超声波震荡器振荡，不分离，将滤液倒人抽滤瓶抽滤．

 3) 抽滤后的液体加入乙酸乙酯5O．00 II1l、50．00 II1l、50．00 I1l，分层以前要不断震荡，在分液漏斗上层分出黄酮类化合物， 下层放出的液体主要为绿原酸．

 4) pH值的变化对绿原酸的提取影响很大，这与绿原酸本身是一种有机酸有关 ．调整pH 2～3，将液体加入正丁醇 20．00 I1l、20．00 II1l、40．00 I1l、萃取3次，(需要放置5～6 h)将萃取液合并约150．00 ml(A)，中间层土黄不透明液体里再加入 25．00 rnl正丁醇、再次分离出的液体合并与(A)．

 5) 将A液体置于500．00 ml梨型瓶旋转蒸发仪蒸去正丁醇，得到少许浸膏．加水溶解后用少量活性炭脱色，过滤，蒸去 水分，放置于40～50℃烘箱中烘干．

 3．2 实 验

 用甲醇将绿原酸对照品配制成3．00、6．00、12．00、 l5．00、24．00、3O．00 mg·L 的标准溶液，用分光光度计在波长 324肿下测得绿原酸含量39．5％ ．用电子秤称取1．20 mg绿原酸粗 品，在lO．00 II1l容量瓶中溶解．本实验用安瓶法，打开仪器，当仪器 稳定在37℃并且基线稳定后，将安瓶放在灭菌台上消毒15 min．待 仪器基线稳定后，取灭菌后的盛有8．00 ml培养基的试管8支，加 入不同体积的药液，0．10、0．20、0．50、0．60、0．70、0．80、0．90、1．00 ml 配成0．014 5、0．029 27、0．071 59、0．o83 72、0．096 55、0．109 0、0．121 3．0．133 3 g·L 的绿原酸大肠杆菌溶液．然后以无菌手续接种标准 菌种，摇匀，即为混悬液，移人8个安瓶中，封口后放人仪器中预 热，待恒温后，测量并记录安瓶内大肠杆菌在药物作用下代谢的热 功率一时问曲线，待曲线回到基线后，即认为实验结束．

 3．3 测热谱曲线(见图1)

 图1大肠杆菌在不同浓度绿原酸下的热动曲线

 4．1 计算生长速率常数

 将试验中绿原酸的浓度C(ch1)g·L～；生长速率常数u／trim 和相关系数r列于表1．

 表1 大肠杆菌在不同浓度绿原酸作用下的生长速率常数

 当细菌的代谢热功率一时间曲线返到基线即认为实验结束，大约需要lO～l2 h．测定了37℃时，不同浓度(c)的Chl对大 肠杆菌代谢作用的热功率一时间曲线．计算出生长速率常数．

 4．2 最小抑菌浓度

 在细菌代谢的指数生长期，细菌群体生长模型遵循logistic方程．用热活性检测仪测出不同浓度绿原酸中大肠杆菌生长代谢的热功率一时问曲线，即Pt—t曲线，用logistic方程处理该曲线上的数据，由表1数据可确立 一c的 关系．计算得到ch1的最小抑菌浓度MIC为13．20 nag·L～．

 另外有报道 J，绿原酸中加入口一环糊精可以有效的防止水解的 产生．随着绿原酸药物浓度的增加抑菌作用逐渐增强，绿原酸在高浓 度时对大肠杆菌有明显的拟菌效用，但有时当浓度极低时反而转化为 促菌作用，这说明中药成分的复杂性．

 图2 Chl对大肠杆菌代谢作用的热谱曲线

 随着各种抗菌素的广泛应用，细菌的耐药性问题变得越来越突 出，几乎所有的细菌都有各自对抗各种抗生素的耐药株型 J．一些中 草药复方制剂和中草药提取物制剂的疗效与青霉素等抗生素相当，有 的疗效甚至高于抗生素，且不存在耐药性和药残问题．我国的中药药 源广、种类多、使用方便、价格便宜，复方制剂在治疗及预防人畜疾病 有巨大作用．因此，大力开发中药，优化提取工艺，确定有效成分及其 作用机理，研制新型兽药防治畜禽疾病，具有良好的发展前景．

绿原酸专业生产企业：www.staherb.com   上禾生物  staherb@staherb.com