积雪草中皂甙类成分的常规分离方法是采用硅 胶柱反复分离，然后重结晶获得¨ 。目前市场上销 售的积雪草甙和羟基积雪草甙两种对照品主要是通 过该方法获得的，产品的纯度在95％ 以下。有采用 高速逆流色谱法从积雪草中分离获得毫克级的皂甙 类成分的报道¨ 。本文采用制备型高效液相色 谱法(Pre—HPLC)，在20 min的分离时间内完成分 离，制备了积雪草甙和羟基积雪草甙两个成分。通 过薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)对 获得的产品进行分析，产品纯度达到98％ 以上，可 以作为积雪草甙和羟基积雪草甙对照品使用。本方 法制备积雪草甙和羟基积雪草甙对照品具有高效快 速、产品纯度高的特点，可以作为制备高纯度的积雪 草甙和羟基积雪草甙对照品的方法。

 1 实验部分

 1．1 仪器与试剂

 Waters Delta 4000制备型高效液相色谱仪，配 996型二极管阵列检测器；Waters 2695型高效液相 色谱仪，配996型二极管阵列检测器(美国Waters 公司)；N—N型旋转蒸发仪(日本Eyela公司)；X一4 数字显示显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公 司)。甲醇(色谱纯，中国禹王公司)；乙腈(色谱纯， Fisher Chemicals公司)；实验用水由Milli Q纯水 系统制备。积雪草粗甙提取物(广西昌洲天然产物 开发有限公司)；积雪草甙、羟基积雪草甙对照品 (中国生物制品检验鉴定所，定性分析用)。

 1．2 色谱条件

 制备型HPLC条件：自填Microsorb C 柱(50 mm ×200 mm，5 m)；流动相：甲醇一水(体积比为 60：40)，流速100 mL／min；检测波长：220 nm；进样 量：1．5 mL。

 分析型HPLC条件：大连江申公司装填的Mi— crosorb C18柱(4．6 mm ×250 mm，5 m)；流动相： 甲醇一水(体积比为60：40)，流速1 mL／min；检测波 长：200 nm；进样量：10 L。

 1．3 样品处理

 称取积雪草粗甙样品6 g，甲醇溶解，配制成浓 度为40 mg／mL的溶液，过0．45 m 微孔滤膜，供 样品分析和制备使用。

 1．4 样品分析

 取按照“1．3”节方法处理后的样品溶液适量， 用甲醇稀释10倍后进行分析，以积雪草甙、羟基积雪草甙对照品为对照，采用外标法定量，积雪草粗甙 样品中含有积雪草甙20％ ，羟基积雪草甙45％ 。

 1．5 样品制备

 采用制备型HPLC系统进行制备纯化，多次进 样，收集积雪草甙和羟基积雪草甙所在部分洗脱液， 减压浓缩后，置于烘箱内干燥，得到0．8 g积雪草甙 和2 g羟基积雪草甙。图1为积雪草粗甙的制备色 谱图。

 2 结果与讨论

 2．1 制备色谱条件的优化

 制备色谱条件的优化从样品的溶解开始。通过 分析型色谱来优化分离条件，然后运用线性放大技 术在制备色谱中放大。

 通过优化色谱条件使目标成分与干扰成分在分 析型色谱中的分离度 大于2，保证分析型色谱条 件放大后经简单调整即可在制备型色谱中达到满意 的效果。使用反相制备色谱制备对照品时，通常小 的保留因子k对制备分离更有利，因为小的保留因 子k意味着小的出峰体积及洗脱液中化合物具有更 高的浓度¨ 。本实验中积雪草甙和羟基积雪草甙 的k分别约为3．2和5．2。

 制备型色谱流动相的流速、进样量分别按照如 下放大公式计算：F =F ×(D ／D ) ，L =L × (D ／D ) (式中Fp为制备型色谱流动相流速， 为分析型色谱流动相流速，D 为制备柱的直径，D 为分析柱的直径， 为制备型色谱进样量， 为分 析型色谱进样量)。考虑到在制备过程中的产品产 率、纯度及溶剂消耗，适当调整并最终确定了“1．2” 节所述的制备色谱条件。

 2．1．1 样品溶解条件的选择

 选择合适溶剂溶解样品对样品的制备是重要的一环。所选择的溶剂应对样品具有很高的溶解度， 不干扰样品的分离，容易处理。本文比较了丙酮、甲 醇、乙腈、水、N，N_-甲基甲酰胺、四氢呋喃，其中 N，N-Z．甲基甲酰胺对样品的溶解性最好，甲醇次 之。使用Ⅳ，Ⅳ．二甲基甲酰胺溶解样品时，需使用特 殊的滤膜，且后处理复杂，故本实验没有使用该溶 剂。本实验使用甲醇作为溶剂溶解样品，得到浓度 为40 mg／mL的样品溶液。

 2．1．2 流动相的选择

 甲醇一水作为流动相组分具有价格低廉的特点， 可以作为反相制备色谱流动相组成的首选。通过优 化甲醇一水的比例、流动相流速使样品达到需要的分 离效果。流动相比例、流速会影响样品的分离效果、 分离时间、目标成分浓缩效果等多个方面。根据本 实验所用分析柱和制备柱的规格，制备色谱中流动 相理论流速应为118 mL／min，实际实验中采用的流 动相流速为100 mL／min。

 2．1．3 最佳进样量的选择

 制备色谱以获得大量的单成分为目的，所以确 定最佳进样量是制备色谱优化的一个主要方面，希 望通过加大进样量，寻找保证分离效果的最大过载 进样量来提高工作效率。加大进样量由样品溶液的 浓度和进样体积两方面决定。在确定了样品溶解条 件后，样品溶液的浓度即已确定。在样品浓度一定 的情况下，通过增大进样体积来增大进样量。随着 进样量的增加，目标成分与相邻成分的分离度会逐 渐降低，影响目标组分的分离，进样量达到一定量 后，相邻成分无法分离 。

 在样品质量浓度为40 mg／mL条件下，考察了 不同进样体积(0．8～2 mL)对分离度的影响。实验 结果表明，0．8～1．5 mL进样体积范围内，目标成分 与干扰成分分辨率逐渐降低，峰重叠加重；进样体积 大于1．5 mL后，目标成分与干扰成分重叠严重，无 法选取适当的切割位置，使目标成分的纯度无保证。 因此，本实验选择进样体积为1．5 mL。

 2．1．4 检测波长的选择

 与分析型色谱相比较，制备色谱所选择的检测 波长并不一定是目标成分的最大吸收波长，选择一 个可以监测到目标成分和干扰成分分离的波长更加 合适¨ 。在逐渐加大样品进样量的情况下，如优先 选择目标成分的最大波长，很容易发生色谱柱未超 载，而检测信号已经过载的情况，即色谱峰在未达到 柱过载情况时即为平头峰，影响对最佳进样量的优 化。此外，在目标成分的最大吸收波长下，干扰成分 的色谱峰很容易受到目标成分色谱峰的影响，成为目标成分色谱峰的前沿峰或拖尾峰，甚至被目标成 分色谱峰掩盖，不便于观察收集。积雪草甙和羟基 积雪草甙为三萜皂苷类成分，低波长为其可用检测 波长。图2为积雪草甙和羟基积雪草甙的紫外 可 见光吸收光谱，积雪草甙和羟基积雪草甙的最大吸 收波长为199．5 nm，如在此波长进行制备，目标色 谱峰在较少进样量时已经表现为平头，目标色谱峰 与干扰成分峰相互干扰严重，无法准确完成馏分收 集，所以本实验在220 nm检测，可达到实验要求。

 2．2 产品的纯度检测

 2．2．1 熔点测定

 测得所制备的积雪草甙的熔点为231～232℃ ， 羟基积雪草甙的熔点为218～219℃ 。

 2．2．2 薄层色谱分析

 取产品与对照品溶液分别点于同一硅胶G板 上，上行展开，展开剂为氯仿一甲醇一水(体积比为7：3 ：0．5)，显色剂为10％ 硫酸乙醇溶液，在110℃下加 热至斑点清晰，产品在对照品相应呈现的比移值处 显相同颜色的斑点，在其他位置无斑点。

 2．2．3 高效液相色谱分析

 精密称取产品和对照品各10．0 mg，用少量流 动相溶解并定容至10 mL，按照“1．2”节分析型色谱 条件分析。采用峰面积归一化法定量，积雪草甙制 备品含量为98．49％，羟基积雪草甙制备品含量为 99．14％；采用外标法定量，积雪草甙产品相对对照 品的含量为103．98％，羟基积雪草甙产品相对对照 品的含量为103．18％。本方法所制备的积雪草甙和 羟基积雪草甙相对对照品含量均大于103％，这是因 为购买的对照品用于定性分析，含量低于98％，所以 采用外标法测定结果含量大于103％。图3为经制 备获得的积雪草甙和羟基积雪草甙产品的HPLC纯 度分析图。

 3 结论

 对照品纯度是中药化学对照品的表征参数。作 为传递量值的标准物质，中药化学品本身的纯度对 被测物质的量值准确性是至关重要的。本实验采用 薄层色谱法、高效液相色谱法对对照品纯度进行纯 度分析。采用归一化法和外标法进行定量，积雪草 甙和羟基积雪草甙纯度均达到98％ 以上。本方法 具有高效快速的特点，可以用于积雪草甙和羟基积 雪草甙对照品的制备，通过放大技术可以用于更大 规模对照品的制备。