摘 要：目的 建立金银花主要有效成分绿原酸总量的快速比色测定方法。方法 采用酚类物质中酚羟基与三氯化铁的显色反应，对绿原酸与三氯化铁的显色反应的一些特征参数，如：显色反应的条件、显色产物的吸收波长、稳定性、标准工作曲线及回收率等，进行考察与测定。结果 该显色反应物的检测波长为755 nm；以绿原酸的吸光度和浓度得出工作曲线，回归方程为Y（µg/ml）＝231.77 X＋5.4114，相关系数为0.9982；绿原酸的浓度在0～181.0µg/ml范围内符合比耳定律，表观摩尔吸收系数ε＝1.495×10³ L·mol^-1·cm^-1，检出限为3.78 µg/ml、回收率为92.22%。结论 该方法简单、快速、廉价，可望用于中药材金银花质量的快速检测与评价，指导其生产实践。

关键词：金银花；绿原酸；快速测定；比色法 金银花绿原酸 上禾生物

中图分类号： 656            文献标识码：A

金银花(Lonicera japonica)，又称忍冬，是常见中药材之一，具有抗氧化、清除自由基、降血脂、降血压、预防心血管病、抗突变、抑菌解毒、消炎利胆等多种药理活性功能，其主要有效成分为绿原酸(chlorogenic acid ，CHA)^[1-6]。常用的绿原酸含量的测定方法主要有紫外分光光度法（UV）、高效液相色谱（Rp- HPLC）法以及高效毛细管电泳（HPCE）法等^[7-9]。本研究建立了一种既可迅速测定其含量而又廉价的快速检测方法。

与三氯化铁的显色反应，是酚类物质的重要化学特性之一。这种特殊的显色反应，可以用来检验酚羟基的存在^[10]。初步研究表明，该反应也可应用于定量分析。本研究拟在此基础上，对绿原酸与三氯化铁的显色反应的一些特征参数，如：显色反应的条件、显色产物的吸收光谱与稳定性、标准工作曲线及回收率等进行考察与测定，为研究、建立金银花中绿原酸总量的快速测定方法提供参考。

1材料与方法

1.1主要仪器和试剂

  主要仪器：岛津UV2550型紫外分光光度计，722可见分光光度计， KQ-250DE型医用数控超声波清洗器（功率100%）。主要试剂：绿原酸 (购自Sigma公司，纯度为95％)，显色剂为0.01 M FeCl₃甲醇溶液，甲醇（购自Mark公司，色谱纯）。供试金银花购自药店。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制  准确称取绿原酸标准品，将原液配制成254μg／ml，并配制出浓度分别为181.0、150.8、120.6、87.6、60.3、30.2、15.1和0 µg/ml的各标准溶液。

1.2.2样品液的制备  取烘干后金银花，粉碎、过40目筛、混匀；准确称取后置于10ml带塞玻璃管中，加入50% 甲醇水溶液10 ml，加盖；经超声提取30 min后，过滤，滤液置于25 ml容量瓶，滤渣再按上述方法加提取液5 ml，用同样方法再过滤1次，并将滤液并入第1次滤液中。最后加提取剂定容，备用。

1.2.3显色反应 分别移取一定量的绿原酸标准品原液的稀释液或金银花提取液于10 ml具塞玻璃试管中，加入显色剂，摇匀，静置。

2  结果

2.1  显色反应原理

    与三氯化铁的特殊显色反应，被认为是检测酚类物质的定性方法，其反应式为6ArOH+FeCl₃→[Fe (OAr)₆]^3- + 6H⁺+3Cl^-[10]。绿原酸也是一种酚类物质，其结构如图1所示^[11]。初步试验表明，绿原酸与三氯化铁的显色反应产物的吸光度与绿原酸的含量呈良好的线性关系，而反映金银花质量的指标性成分即为绿原酸。因此，该反应可用于金银花中绿原酸含量的测定。

                                           图1绿原酸的化学结构图

2.2  最佳实验条件的选择

鉴于绿原酸是中药材金银花中的主要指标性成分^[1,2,4]，因此本研究以绿原酸标准品制作标准工作曲线，显色溶液的吸收光谱扫描、方法建立和评价均在岛津UV2550型紫外分光光度计上完成。

2.2.1  吸收光谱及测定波长

橙黄色的FeCl₃溶液可与无色透明的绿原酸甲醇溶液反应，从而生成深绿色络合物质。对上述显色方法中的空白液和试样液进行光谱扫描，结果见图2。由图2可知，该显色反应物可见光范围内的最大吸收峰的波长为755 nm。

                                   图2 显色产物的吸收光谱

             注：LU为绿原酸扫描图谱；Fe为氯化铁溶液扫描图谱；LU+Fe反应后扫描图谱。

2.2.2  显色条件的选择

初步试验表明，该显色反应与反应的时间和温度有较大的关系，同时显色剂FeCl₃溶液的加入量也显著影响显色反应的进行。因此，在选择、优化显色条件时，本研究采用三因素三水平正交试验方案L₉（3⁴）。正交试验的方案设计与结果分析详见表1和表2。

表1  L₉(3⁴)正交试验和水平

试验结果（表2）表明，显色剂FeCl₃的用量对显色反应的影响较大，而反应时间的影响较小。显色剂用量越低，其吸光度越高，这可能是由于FeCl₃在水中发生水解反应，即：2FeCl₃+6H₂O→      2Fe(OH)₃+6H⁺+6Cl^-；显然，该反应会使溶液的酸度加大，进而抑制络合反应（6ArOH+FeCl₃→ [Fe(OAr)₆]^3-+6H⁺+3Cl^-）的进行。因此，应该严格控制显色剂FeCl₃的用量。从总的来看，各因素的最优水平组合是 A₂B₁C₂，即：在35℃下加入0.01M FeCl₃溶液0.5 ml、反应60 min作为试验条件。

表2  L₉(3⁴)正交试验结果及其分析

2.3  反应产物的稳定性                         

图3. 络合产物随时间变化扫描图谱

将反应产物在可见光光谱下进行扫描，结果见图3。由图3可知，该显色反应产物生成后的前60 min还不太稳定，其在最大吸收峰波长755 nm处的吸收值大小，依次为3 min<10 min <25 min<30 min<45 min<60 min；60 min后，即：在第60、70、80和90 min时，其反应产物的吸收值趋于稳定。

2.4  标准曲线的制定                 

将1.2.1中的各浓度梯度的绿原酸标准液，在2.2所得的优化试验条件下，即：分别在35℃下加入0.01M FeCl₃溶液0.5 ml、反应60 min，以755 nm为检测波长，用可见光分光光度计测定各反应物溶液的吸收值；若以绿原酸标准溶液的浓度为纵坐标，以反应产物的吸收值为横坐标，即可绘制出标准工作曲线（图4）。图4表明，在0～181.0 µg/ml范围内，绿原酸的浓度与吸光度值呈良好线性关系，回归方程为：

Y（µg/ml）＝231.77X＋5.4114，R²＝0.9982,ε＝1.495×10³L·mol^-1·cm^-1

2.5  检出限

将空白试样在分光光度计下连续测定20次，据IUPAC计算得出其检出限为3.78 µg/ml，RSD=3.1%。

2.6  精密度考察

对浓度为120.65 µg/ml的标准溶液连续测定5次，其平均值为121.99 µg/ml，RSD=0.30%。

2.7  重复性试验

    将同一供试金银花样品分成3份，依法测定，其绿原酸含量的平均值为2.25%，RSD=2.20%。  

2.8  回收率测定

按样品液制备和测定方法进行定量分析，将测定结果扣除样品中绿原酸的含量，与加入标准品量的比值，为加样回收率。测定结果为92.22%。

2.9  应用

    应用上述研究确定的测定方法，对购自药店的3个金银花成品进行测定，其结果见表3。

                            表3 金银花样品中绿原酸含量

3   讨 论

   通过上述试验结果可知,利用酚类物质与三氯化铁的特殊显色反应原理研究、建立金银花主要有效成分绿原酸含量的快速测定方法是可行的。我们可根据试验所获得的有关参数值将其制成便携式小型光谱测定仪^[12]，用于金银花的生产实践和市场流通过程中的质量检验与控制。

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Rapid Determination of Chlorogenic Acid in Flowers of Lonicera japonica

ZHANG Qiu-fang，LIU Bo，SHI Huai，HUANG Su-fang

( Biotechnology Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350003，China )

Abstract: Objective  To establish the method of rapid determination of chlorogenic acid in flowers of Lonicera japonica. Methods  According to the color reaction,which is the specific color reaction occurring in FeCl₃ and phenolic hydroxide group, we test the reactting conditions, wavelength, stability, standard operation curve and recovery rate so on.  Results  756 nm was chosen as the detective wavelength. The regression equation was Y（µg/ml）＝231.77 X＋5.4114, r=0.9982. The molar absorptivity is 1.495×10³ L·mol^-1·cm^-1.The detective limit is 3.78µg/ml and the recovery is 92.22%. Conclusion  The simple, rapid and low-cost method can be applied to evaluate the quality of Lonicera japonica in marketing and instruct plant in farming.

Key words: Lonicera japonica；Chlorogenic Acid；Rapid Determination；Colorimetry

第一作者：张秋芳，女，出生于1973年8月，硕士，助研。

工作单位和地址：福建省农业科学院生物技术研究所，福州市五四路247号

邮编350003

联系电话：13055748230