大黄中主要成分清除超氧阴离子自由基的

 摘      要

ABSTRACT目的：通过研究蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum L．）中主要成分大黄酸（Rhein）、芦荟大黄素(Aloe-emodin)、大黄素(Emodin)、大黄素甲醚(Physcion)和大黄酚(Chrysophanol)清除超氧阴离子自由基（O₂˙）的作用，从分子生物学的角度探讨大黄延缓衰老作用的可能机理。

方法：1．采用pH梯度萃取法提取分离大黄的主要成分大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚，并采用硅胶柱色谱法分离大黄素甲醚和大黄酚。

2．应用熔点测定法、薄层色谱法、紫外光谱法及高效液相色谱法鉴定并测定其纯度。

3．以二甲基亚砜（DMSO）在碱性有氧条件下产生超氧阴离子自由基（O₂˙），利用公式E＝(h₀－h_x)/h₀×100%（其中E为清除率，h₀为加药前O₂˙的信号强度，h_x为加药后O₂˙的信号强度），采用电子自旋共振法（ESR）检测体系中O₂˙信号强度，通过与未加药样的空白体系中O₂˙信号强度的比较，以VitC为阳性对照，研究大黄中主要成分大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚对超氧阴离子自由基（O₂˙）的清除能力。

结果：大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚均有良好的清除超氧阴离子自由基（O₂˙）的作用，随着药物浓度的增高，对O₂˙的清除作用增强，呈剂量依赖性。大黄酸、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和VitC对O₂˙的清除率为100％时的浓度分别为0.06mg/ml、0.39mg/ml、0.46mg/ml、6.82mg/ml、1.18mg/ml、0.72mg/ml。

结论：大黄所具有的延缓衰老的作用，可能与其所含的主要成分大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚具有清除O₂˙的能力有关。

主题词：大黄/药理学

蒽醌类/药理学

抗氧化药/药理学

自由基清除剂/药理学

衰老/药物作用

电子自旋共振谱学/方法

ESR study on the scavenging effects of the main ingredients in

Rheum palmatum L. on superoxide anion radical

    Objective  To study the scavenging effects of Rhein、Aloe-emodin、Emodin、Physcion and Chrysophanol which were the main ingredients in Rheum palmatum L．on superoxide anion radical and to investigate the mechanism of Rheum palmatum L．in retarding aging at molecular biology lever．

Method  1．Rhein、Aloe-emodin、Emodin、Physcion and Chrysophanol in Rheum palmatum L．were isolated respectively by pH gradient extraction method.And column chromatography was used to isolate and purify Physcion and Chrysophanol.

2．The melting point method、thin layer chromatography 、ultraviolet spectrophotometry and high performance liquid chromatography methods were used to identify and evaluate the purity of the the main ingredients in Rheum palmatum L．

3．The superoxide anion radical（O₂˙） was produced in the alkaline dimethyl surfoxide（DMSO） system and electron spin resonance（ESR）was used to measure the signal intensity of it.The formula was:E=(h₀－h_x)/h₀×100%（In it E was the clearance rate, h₀ was the signal intensity of O₂˙before the drug was added,hx was the signal intensity of O₂˙after the drug was added）.The method was used to observe the scavenging effect on the superoxide anion radical（O₂˙）of Aloe-emodin、Rhein、Emodin、Physcion and Chrysophanol through comparing the signal intensity of O₂˙which the drugs had been added with those not added ones,VitC was the positive control ones.

Results  All of the Rhein、Aloe-emodin、Emodin、Physcion and Chrysophanol were effective in scavenging the superoxide anion radical（O₂˙）produced in the alkaline DMSO system，and the ability was dose- dependent．When the clearance rate reached 100%,the concentrations of Rhein、Chrysophanol、Emodin、Aloe-emodin、 Physcion、and VitC were 0.06mg/ml、0.39mg/ml、0.46mg/ml、6.82mg/ml、1.18mg/ml、0.72mg/ml．

Conclusions：Rheum palmatum L．has the effect of retarding aging．Perhaps this is relevant to the scavenging effect on the superoxide anion radical（O₂˙）of the main ingredients in the herb．

Key words： rheum palmalum/pharmacol

           anthraquinones/pharmacol

antioxidants/pharmacol

free radical scavengers/pharmacol

aging/drug effect

electron spin resonance spectroscopy/methods

前      言

INTRODUCTION

进入21世纪后，人类面临人口老龄化的严峻挑战，许多国家（包括我国）已经进入人口老龄化社会，≥60岁的老年人占总人口的10％以上。目前，我国老年人已达1亿三千多万，衰老严重地困扰着老年人，直接影响他们的健康状况和生活质量。延缓衰老这一世界性的医学课题在我国日益受到普遍关注。探明衰老的本质及寻找有效的延缓衰老药物已成为当前老年医学领域中的研究热点。

祖国传统医学不仅在长期积累中形成了独特的延缓衰老理论，而且在延年益寿的实际应用中确实发现了许多具有延缓衰老作用的单味药和复方制剂。在科学技术的发展和对衰老机理研究逐步深入的推动下，研究的重点也从生物体整体或组织逐渐过渡到细胞、亚细胞、分子生物学水平，并运用跨学科知识对延缓衰老理论及药物的作用机理进行全面探索和综合评价。许多学者对传统中药在寿命实验，防御自由基损害，抗突变能力，改善循环，调节免疫、神经系统、内分泌功能及新陈代谢等方面进行了较为系统的现代药理学研究，显示这一领域蕴藏着巨大的开发潜力。因此，从天然药物中筛选和开发疗效确切、安全无毒的新药是当前延缓衰老研究中的思路之一。

提取中药有效成分或有效部位，开发单味药及复方中药制剂中单味药的有效成分或有效部位是新药研发中的趋势。大黄是一种极有开发价值的药用植物，其化学成分、药理作用和临床应用均进行了较深入的研究，它在清除氧自由基、降血脂、抗动脉硬化、抗癌、延缓衰老等方面都有显著的药理作用^[1]。大黄及其组成的复方具有延年益寿、延缓衰老的作用^[2][3][4]，大黄单味药提取液能清除自由基^[5][6]。大黄作为传统的抗衰老药物^[7][8]，显示了良好的延缓衰老作用。

国内外有关衰老机制的学说很多，如自由基学说、交联学说、内分泌学说、差错学说、免疫学说、脂褐素学说、基因学说、生物膜损伤学说、微量元素学说、自体中毒学说、剩余信息假说等^[9]，这些学说从不同角度、不同层面阐述了衰老的机理，其中自由基学说与衰老关系的研究异常活跃，自由基学说已被公认为人类衰老机理现代理论中具有代表性的学说之一。

自由基是指在原子的外层轨道上具有未配对电子的原子、原子团或分子的总称。在生物体内常见的自由基种类很多，而超氧阴离子自由基是其中很重要的一种，它会诱发其它自由基的生成。大多数自由基是不稳定的，存在的时间很短，但由于其化学性质极其活泼，所以作为反应中间物在生物体内起着重要作用。正常情况下机体内自由基的产生与清除维持在一个正常的生理水平上，过多或过少都会给机体造成损伤。当这一平衡被破坏，自由基产生过多或清除能力下降，在体内积聚，就会引起生物大分子如脂质、蛋白质、核酸的损伤，导致细胞结构的破坏和机体的衰老^[10]。自由基的含量随年龄的增长而升高，由自由基促成的脂质过氧化作用及生成的过氧化脂类随年龄而增加。机体衰老时，抗氧化系统抗氧化能力下降，自由基代谢产物丙二醛（MDA）含量增加，引起组织损害和器官退行性变化，进而加速机体衰老^[11]。

因此，我们拟采用电子自旋共振法，以二甲基亚砜（DMSO）在碱性有氧条件下产生超氧阴离子自由基（O₂˙），观察大黄中主要成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚清除超氧阴离子自由基（O₂˙）的能力，尝试从清除自由基的角度探讨大黄延缓衰老作用的可能机理。

一、实验用仪器与试药

MATERIALS

1  生大黄药材

为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum L．）的干燥根茎，由甘肃药材有限责任公司提供，经福建中医学院药学系药用植物教研室卢伟副教授鉴定，符合《中华人民共和国药典》（2000年版）规定。

2  主要试剂

（1）石油醚（30～60℃）（AR）                上海联试化工试剂有限公司

（2）石油醚（60～90℃）（AR）                上海联试化工试剂有限公司

（3）醋酸乙酯（AR）                            上海试剂四厂昆山分厂

（4）甲酸（AR）                                广东汕头市西陇化工厂

（5）环己烷（AR）                       中国医药集团上海化学试剂公司

（6）正己烷（AR）                       中国医药集团上海化学试剂公司

（7）乙醚（AR）                         中国医药集团上海化学试剂公司

（8）三氯甲烷（AR）                     中国医药集团上海化学试剂公司

（9）甲醇（AR）                            中国联试化工试剂有限公司

（10）甲醇（色谱纯）                     中国医药集团上海化学试剂公司

（11）磷酸（AR）                        中国医药集团上海化学试剂公司

（12）氨水（AR）                           中国联试化工试剂有限公司

（13）甲酸乙酯（AR）                    中国医药集团上海化学试剂公司

（14）异戊醇（AR）                      中国医药集团上海化学试剂公司

（15）丙酮（AR）                           中国联试化工试剂有限公司

（16）吡啶（AR）                           中国联试化工试剂有限公司

（17）掌叶大黄对照药材（批号：0902－9806）      中国药品生物制品检定所

（18）大黄酚对照品（批号：0757－200005）        中国药品生物制品检定所

（19）大黄素甲醚对照品（批号：758－200006）     中国药品生物制品检定所

（20）大黄素对照品（批号：110756－200110）      中国药品生物制品检定所

（21）芦荟大黄素对照品（批号：0795－9803）      中国药品生物制品检定所

（22）大黄酸对照品（批号：757－9302）          中国药品生物制品检定所

（23）抗坏血酸（AR）                    中国医药集团上海化学试剂公司

（24）薄层层析硅胶H（60型）（CP）            中国青岛海洋化工集团公司

（25）薄层层析硅胶G（60型）（CP）            中国青岛海洋化工集团公司

（26）层析用硅胶（100～200目）                    上海五四化学试剂厂

（27）羧甲基纤维素钠（CMC－Na）                上海化学试剂站分装厂

3  主要仪器

（1）ER－420型电子自旋共振波谱仪                     德国Bruker公司

（2）TSP高效液相色谱仪                                美国TSP公司

（3）TSP－P2000二元梯度泵                              美国TSP公司

（4）TSP－UV2000双波长紫外—可见检测器                  美国TSP公司

（5）BS－210S型电子分析天平                         德国Satorius公司

（6）BP－211D型电子分析天平                        德国Satorius公司

（7）UV－2100双光束紫外－可见分光光度计         北京瑞利分析仪器公司

（8）SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵                郑州长城科工贸有限公司

（9）101A－1型电热鼓风干燥箱                      上海市实验仪器总厂

（10）WS70－1型红外线快速干燥箱               上海浦东跃欣科学仪器厂

（11）YB－Z型真空恒温干燥箱                      天津药典标准仪器厂

（12）BS－100A型自动部份收集器                     上海市沪西仪器厂

（13）HH－S2型数显恒温水浴锅                上海锦屏仪器仪表有限公司

（14）KQ－5000E型医用数控超声波清洗器         昆山市超声仪器有限公司

（15）WC－1型显微熔点测定仪                          四川大学仪器厂

（16）TN－100B型托盘扭力天平                     上海第二天平仪器厂

（17）pHS－3C型pH计                       上海精密科学仪器有限公司

（18）RE－52C旋转蒸发器                          上海亚荣生化仪器厂

（19）双底展开槽（200mm×200mm）                 上海信谊玻璃仪器厂

二、实验方法与结果

METHODS AND RESULTS

1   大黄的生药学研究

1．1  来源：本品为购自主产地甘肃礼县的蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根及根茎。秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖，除去细根，刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥，即得。

1．2  性状鉴别：本品呈类圆柱形、圆锥形、卵圆形或不规则块状，长3～17cm，直径3～10cm。除尽外皮者表面黄棕色至红棕色，可见类白色网状纹理及星点(异型维管束)散在，残留的外皮棕褐色，多具绳孔及粗皱纹。质坚实，中心稍松软，断面淡红棕色或黄棕色，显颗粒性；根茎髓部宽广，有星点环列或散在；根木部发达，具放射状纹理，形成层环明显，无星点。气清香，味苦而微涩，嚼之粘牙，有砂粒感，唾液染成黄色。

1．3  显微鉴别

1．3．1 取本品根茎横切面：①木栓层及皮层大多已除去，偶有残留。②韧皮部射线宽一至数列细胞，内含棕色物。韧皮部中有粘液腔。③形成层环明显。④木质部导管稀疏，径向排列，非木化。⑤髓部宽广，有异常维管束，其形成层呈环状，外侧为木质部，内侧为韧皮部，射线呈星状射出，韧皮部中有粘液腔，内含红棕色物质。薄壁细胞含淀粉粒及大形草酸钙簇晶。

1．3．2 取本品粉末：呈淡黄棕色。①草酸钙簇晶多，直径21～125μm，棱角大多短钝。②淀粉粒单粒呈圆球形或长圆形，直径5～32μm，脐点大多呈星状；复粒由2～5分粒组成。③导管多为网纹，并有具缘纹孔及细小螺纹导管，直径11～140μm，非木化。

2   大黄主要成分、结构与性质

大黄主要含八类化学成分：蒽醌类化合物、双蒽酮类化合物、苯丁酮苷类化合物、芪苷类化合物、萘苷类化合物、鞣质及其有关化合物、其它有机化合物、无机物等^[12]，蒽类衍生物是大黄中主要的活性成分^[13]，其主要成分为蒽醌类化合物，总含量约2%～5%，其中游离的羟基蒽醌类化合物占1/10～1/5，主要为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚等，这是五种较为重要的成分^[14]，也是形成蒽醌苷类的主要游离苷元。

大黄游离羟基蒽醌类化合物的化学结构式

2．1 大黄素（Emodin）：分子式C₁₅H₁₀O₅，分子量270.23。橙色长针状结晶（丙酮中结晶）或黄色长针状结晶（甲醇中结晶），mp.256～257℃。几乎不溶于水，对下列溶剂的溶解度分别为：四氯化碳0.01％，氯仿0.0718％，二硫化碳0.009％，乙醚0.14％，苯0.041％。易溶于乙醇、氨水、碳酸钠和氢氧化钠水溶液^[15]。

2．2 大黄酚（Chrysophanol）：分子式C₁₅H₁₀O₄，分子量254.23。金黄色六角型片状结晶（丙酮中结晶）或针状结晶（乙醇中结晶），mp.196℃，能升华。易溶于乙醚、氯仿、苯、冰乙酸、乙醇，稍溶于甲醇，难溶于石油醚，不溶于水、碳酸氢钠和碳酸钠水溶液，可溶于氢氧化钠水溶液及热碳酸钠水溶液^[16]。

2．3 大黄素甲醚（Physcion）：分子式C₁₆H₁₂O₅，分子量284.26。金黄色针状结晶，mp.207℃，能升华。可溶于氢氧化钠水溶液，溶解度与大黄酚相似^[15]。

2．4 芦荟大黄素（Aloe－emodin）：分子式C₁₅H₁₀O₅，分子量270.23。橙色针状结晶（甲苯中结晶），mp.223～224℃。易溶于热乙醇，在乙醚及苯中呈黄色，在氨水及硫酸中呈绯红色^[16]。

2．5 大黄酸（Rhein）：分子式C₁₅H₈O₆，分子量284.21。黄色针状结晶（升华法），mp.321～322℃，330℃分解。几乎不溶于水，溶于碱和吡啶，略溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚^[16]。

3   大黄中化学成分的理化鉴别

3．1 取大黄粉末少量，加碱液呈红色。

3．2 取本品粉末的稀乙醇浸出液，滴于滤纸上，再滴加稀乙醇，扩散后呈黄色至淡棕色环，置紫外光灯（365nm）下观察，呈棕色至棕红色荧光。（检查蒽醌衍生物）

3．3 取本品粉末少量，进行微量升华，显微镜下观察可见菱状针晶或羽状结晶。

3．4 取大黄粉末0.1g，加水50ml，置水浴上加热30分钟，滤过，滤液中加稀盐酸2滴，用乙醚提取二次，每次20ml，除去乙醚层，水层加盐酸5ml，置水浴中加热30分钟，冷却，用乙醚20ml提取，分取乙醚层，加碳酸氢钠试液10ml，振摇，水层显红色。（检查羟基蒽醌衍生物）

3．5 取本品粉末0.1g，加甲醇20ml浸渍1小时，滤过，取滤液5ml，蒸干，加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热30分钟，立即冷却，用乙醚分2次提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。再取大黄酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。（见附图1、2）

4   大黄中游离羟基蒽醌类化合物的ESR试验

4．1 大黄中游离羟基蒽醌类化合物的提取分离和纯化

4．1．1  提取工艺流程图

4．1．2  总羟基蒽醌类成分的提取

称取100g大黄粉末，先加入90ml 95％乙醇，使大黄粉浸润，再加入150～175ml 95％乙醇，在圆底烧瓶中加热回流，趁热抽滤（在该过程中，一定要避免极细小大黄颗粒进入滤液），合并滤液，将滤液移入圆底烧瓶中，旋转蒸馏浓缩，干燥，得含总羟基蒽醌类成分样品。

4．1．3  游离羟基蒽醌类成分的分离

取上述乙醇提取样品，加入150ml水，搅拌，用400ml乙醚，按150、100、100和50ml体积分4次萃取，合并乙醚层，抽滤，将滤液移入圆底烧瓶中，旋转蒸馏浓缩，干燥，得总游离羟基蒽醌类成分样品。

4．1．4  大黄酸的分离和纯化

    称取适量总游离羟基蒽醌样品，溶于200ml乙醚中，用400ml 5％NaHCO₃溶液，按150、100、100和50ml体积分4次萃取，滤过，除去滤渣，合并水层，用盐酸调至pH＝2，出现絮状土黄色沉淀，滤过，先用水洗沉淀数次，再以少量冰冷的丙酮洗涤以除去有色杂质。干燥后以冰醋酸结晶数次，得大黄酸黄色稻草束样针状结晶，mp.321～322℃。供ESR测试用。乙醚层留用。

4．1．5  大黄素的分离和纯化

将大黄酸分离后的乙醚层用400ml 5％Na₂CO₃溶液，按150、100、100和50ml体积分4次萃取，滤过，除去滤渣，合并水层，用盐酸调至pH＝1～2，出现黄褐色絮状沉淀，滤过，先用水洗沉淀数次，再以少量冰冷的丙酮洗涤以除去有色杂质。干燥后以冰醋酸结晶数次，得大黄素橙色大针状结晶，mp.256～257℃。供ESR测试用。乙醚层留用。

4．1．6  芦荟大黄素的分离和纯化

将大黄素分离后的乙醚层用400ml 5％NaOH溶液，按150、100、100和50ml体积分4次萃取，滤过，除去滤渣，合并水层，用盐酸调至pH＝2，出现黄色沉淀，滤过，用热异戊醇将其溶解，滤过，将异戊醇滤液浓缩蒸干，得棕黑色粉末，加入CHCl₃，加热，使其溶解，溶液静置2天，出现黄色析出物，滤过后先用水洗涤沉淀数次，再以少量冰冷的丙酮洗涤以除去有色杂质。干燥后在醋酸乙酯中重结晶，得芦荟大黄素橙色长针状结晶，mp.223～224℃。供ESR测试用。

加热上述氯仿滤液，使滤液中的CHCl₃挥发，得大黄酚与大黄素甲醚的混合物，用醋酸乙酯重结晶，得大黄酚和大黄素甲醚结晶，测得mp.196～207℃。另将热异戊醇中的不溶物用热吡啶溶解，浓缩蒸干，用醋酸乙酯重结晶，亦得大黄酚和大黄素甲醚的黄色结晶，mp.196～207℃。

4．1．7  大黄酚和大黄素甲醚的分离和纯化

合并上述所得大黄酚和大黄素甲醚混合物，用硅胶柱色谱法分离。装柱：取100～200目层析用硅胶250g，加石油醚(60～90℃)适量,调成混悬液，然后将其慢慢地、连续不断地倾入层析柱内（4.5×50cm），开启下端活塞，使石油醚慢慢流出，带动吸附剂缓慢沉于柱的下端，待加完吸附剂后，继续使石油醚流出，直至吸附剂的沉降不再变动，将多余的石油醚放出至上面保持有5cm高度的液面为止。吸附剂高度约25cm。加样：将大黄酚与大黄素甲醚1g，溶于适量氯仿，加吸附剂硅胶15g拌匀，除尽氯仿，再将其均匀铺于柱顶。洗脱：开启活塞，使高出样品层的液面降至与样品层上面齐平，再加石油醚至有1cm高液面，重复上述操作2～3次。然后将洗脱剂石油醚置于分液漏斗中，开启活塞，慢慢连续不断地滴加在柱床上部，同时开启层析柱下端活塞进行洗脱，流速控制在6～8m1/min。先洗脱者为大黄酚，后洗脱者为大黄素甲醚。纯化：大黄酚用醋酸乙酯重结晶纯化，得橙黄色叶状结晶，mp.196℃。供ESR测试用。大黄素甲醚用醋酸乙酯重结晶纯化，得橙黄色针状结晶，mp.207℃。供ESR测试用。

4．2 大黄中提取的游离羟基蒽醌类化合物的纯度鉴别与测定

4．2．1  薄层色谱法（TLC）鉴别

（1）薄层硅胶板的制备^[17]    配制0.5％羧甲基纤维素钠水溶液，静置1周，取上清液与薄层层析硅胶H（60型），按3：1配制调浆，在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板(20cm×20cm)上平稳地移动涂布器进行涂布，取下涂好薄层的玻板，于室温下，置水平台上晾干，在反射光及透射光下检视，表面应均匀，平整，无麻点、无气泡、无破损及污染，于110℃下活化30min，冷却后立即使用或置干燥器中备用。

（2）五种游离羟基蒽醌类成分的TLC鉴别  经薄层色谱检查，薄层板为硅胶H加0.3％羧甲基纤维素钠水溶液自制板，展开剂为石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上层溶液，上行展开，展距约10cm，取出，晾干，经氨蒸气熏后，在可见光下可看到五个斑点，Rf值大到小分别为大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸和芦荟大黄素。（见附图3）

（3）大黄酸的TLC鉴别  经薄层色谱检查（薄层色谱条件同上），在与大黄酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色黄色斑点；置紫外光灯（365nm）下检视，在与大黄酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色橙色斑点，无其它杂质斑点出现。（见附图4、5）

（4）大黄素的TLC鉴别  经薄层色谱检查（薄层色谱条件同上），在与大黄素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色橙色斑点；置紫外光灯（365nm）下检视，在与大黄素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色橙色斑点，无其它杂质斑点出现。（见附图6、7）

（5）芦荟大黄素的TLC鉴别  经薄层色谱检查（薄层色谱条件同上），在与芦荟大黄素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色黄色斑点；置紫外光灯（365nm）下检视，在芦荟大黄素对照品色谱相应的位置上显相同颜色橙色斑点，无其它杂质斑点出现。（见附图8、9）

（6）大黄酚的TLC鉴别  经薄层色谱检查（薄层色谱条件同上），在与大黄酚对照品色谱相应的位置上，显相同颜色黄色斑点；置紫外光灯（365nm）下检视，在与大黄酚对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，无其它杂质斑点出现。(见附图10、11)

（7）大黄素甲醚的TLC鉴别  经薄层色谱检查（薄层色谱条件同上），在与大黄素甲醚对照品色谱相应的位置上，显相同颜色黄色斑点；置紫外光灯（365nm）下检视，在与大黄素甲醚对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，无其它杂质斑点出现。(见附图12、13)

4．2．2  紫外光谱法（UV）鉴别

分别精密称取所提取的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚各1mg，分别置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。以甲醇作空白，在紫外分光光度计上于200nm～400nm区间扫描测定紫外光谱。结果，最大吸收波长分别为：芦荟大黄素287nm、254nm、225nm、202nm，大黄酸258nm、231nm、204nm，大黄素289nm、266nm、253nm、222nm，大黄素甲醚286nm、265nm、253nm、223nm，大黄酚287nm、265nm、225nm、202nm。与文献报道一致^[18][19]。紫外光谱图见附图14～18。

4．2．3  高效液相色谱法（HPLC）鉴别及纯度测定

（1）色谱条件

Diamonsil^TM（钻石）C₁₈（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱,北京迪马公司；JS－3030型色谱工作站，大连江申分离科学技术公司；流动相：甲醇－0.1%磷酸溶液(85∶15)；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：室温。理论板数按大黄素峰计算应不低于1500。

（2）对照品溶液的制备 

分别精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚对照品各5mg，分别置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取上述溶液各1ml，分别置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

（3）供试品溶液的制备

    分别精密称取所提取的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚各5mg，分别置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取上述溶液各1ml，分别置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

（4）测定

分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪。结果表明，所提取的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚的保留时间与芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚对照品的保留时间一致；自制五种游离羟基蒽醌经归一化法进行纯度检查，纯度分别为97.5％、95.6％、97.8％、95.4％、96.7％。

经熔点测定、TLC、UV和HPLC鉴别及纯度测定表明，所提取的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚可供ESR测试用。

4．3  电子自旋共振法测试

4．3．1  操作参数

  利用ER－420型电子自旋共振波谱仪，在液氮温度下检测O₂˙量的变化情况。ESR操作参数件：X波段，调制频率100KHz，调制幅度5G，扫描宽度500G，微波功率20mW，时间常数20ms，中心磁场3300G。

4．3．2  DMSO碱性溶液的配制

   将一定量的固体NaOH溶于蒸馏水中，并标定NaOH溶液浓度。根据实验要求，配成含NaOH 10mmol/L的DMSO溶液，溶液中的含水量均为1%（ml/ml）。

4．3．3  DMSO碱性体系中O₂˙的产生

室温下，将含有饱和空气的DMSO与NaOH溶液、H₂O充分混合，此时溶液中NaOH和H₂O含量分别为5mmol/L和1％（ml/ml），在低温（77K）下进行ESR测定。ESR谱图见附图19所示。

将NaOH溶液和DMSO在混合前分别用真空（0.13Pa）脱气法除氧，然后在与上面相同的浓度和室温条件下将两者混合，结果在相同ESR条件下未检测到ESR信号；再将氧气通入脱气的混合液中，又获得如附图19所示的ESR谱图。

上述试验过程表明O₂直接参与了产生自由基的反应。O₂在DMSO碱性溶液中发生了单电子转移反应，产生O₂˙ 。此反应过程可用下式表示^[20]

2˙OH+3O₂+2(CH₃)₂SO →2CH₃SOOH+CH₃OOCH₃+2 O₂˙

4．3．4  清除率的计算

超氧阴离子自由基的清除率以波谱信号第二峰高值（mm）表示信号的相对强度，用以下公式计算药物对自由基的清除率E：

E＝(h₀－h_x)/h₀×100%

其中，h₀为加药前O₂˙的信号强度（本底峰高）；h_x为加药后O₂˙的信号强度（加药后峰高）。

4．3．5 大黄中五种游离羟基蒽醌成分对超氧阴离子自由基清除作用的ESR检测

分别将含有饱和空气的DMSO溶液与NaOH溶液、H₂O于室温下混合反应，一经加入NaOH立即计时，然后，定量吸取反应液置于直径为3mm的玻璃样品管内，在温度77K时进行ESR测定，此时可检测到O₂˙的特征信号，以此作为空白对照。另取数支样品管，将含有饱和空气的DMSO溶液分别与不同浓度水平的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚提取液、VitC混匀，然后再加入NaOH溶液，一经加入立即计时，充分反应后，用ESR方法检测体系中O₂˙信号强度的变化，通过与未加药样的空白对照体系中O₂˙信号强度的比较，以VitC作为阳性对照，观察芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚对O₂˙的清除作用，分别计算它们的清除率。

4．3．6  大黄中五种游离羟基蒽醌成分对超氧阴离子自由基清除作用的ESR检测结果见下表

①大黄酸                 ②大黄酚               ③大黄素

④VitC                   ⑤大黄素甲醚           ⑥芦荟大黄素

实验结果表明，大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚、VitC对O₂˙的清除率与浓度呈剂量依赖性。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和VitC对O₂˙的清除率为100％时的浓度分别为6.82mg/ml、0.06mg/ml 、0.46mg/ml、0.39mg/ml、1.18mg/ml、0.72mg/ml。附图20（a）显示DMSO捕捉O₂˙后在ESR上呈现的典型波谱，附图20（b）、20（c）、20（d）、20（e）、20（f）、20（g）分别是加入大黄酚、VitC、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酸和大黄素后，当达到100％清除O₂˙后的ESR波谱。由图可见：加入大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚后，ESR波谱的峰值明显下降。说明：大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚均有良好的清除超氧阴离子自由基的能力。

三、讨    论

DISCUSSION

1   祖国医学对大黄延缓衰老机理的认识

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L．、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim．ex Balf．或药用大黄Rheum officinale Bail．的干燥根及根茎。大黄始载于《神农本草经》，主产于四川、甘肃、青海、西藏、湖北、云南、贵州等地，多在秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖，除去细根，刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥。产品因加工不同分为生大黄、酒大黄、熟大黄、大黄炭。生大黄苦、寒；归脾、胃、大肠、肝、心包经；具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经之功，用于实热便秘、积滞腹痛、泻痢不爽、湿热黄疸、血热吐衄、目赤、咽肿、肠痈腹痛、痈肿疔疮、瘀血经闭、跌扑损伤，外治水火烫伤；上消化道出血。酒大黄善清上焦血分热毒，用于目赤咽肿、齿龈肿痛。熟大黄泻下力缓，泻火解毒，用于火毒疮疡。大黄炭凉血化瘀止血，用于血热有瘀出血症。

中医学传统衰老理论，多以“脾肾虚衰致衰老”为基本观点，历代延年益寿方药的运用也多以此为据。延缓衰老研究多以补虚延寿者为主，在众多的延缓衰老药品中，以滋补药品占大多数。我们认为衰老不单由脏腑气血虚弱所致，菀陈瘀滞积蓄亦是重要原因。

菀陈瘀滞的积蓄是衰老的重要原因。菀者积也，陈者久也；瘀者血与津液不流畅也，滞者气不行也；菀陈瘀滞，指体内日渐积蓄的有害物质。衰老的发生是一个逐渐演变的过程，《素问·五脏别论》云：“所谓五脏者，藏精气而不泻也，故满而不能实。六腑者，传化物而不藏，故实而不能满也。所以然者，水谷入口，则胃实而肠虚，食下则肠实而胃虚。故曰：实而不满，满而不实也^[21]”。六腑以通为用，主传化物、消化吸收水谷精微、滋养五脏，而五脏精气，疏达气血，以协调六腑，脏腑为合，相辅相成。年轻时脏腑功能正常，气血旺盛，新陈代谢活跃，少有瘀滞形成者；进入中老年以后，脏腑功能逐渐衰弱，新陈代谢日渐迟缓，气行迟则滞，血流缓则瘀，津液输布不利渍而成痰湿，饮食不化、或肥甘厚味过剩，则聚为菀陈。此既为脏腑虚衰的病理产物，又是导致脏腑功能进一步减退的致病因素，因此《灵枢·营卫生会篇》云：“老者之气血衰，其肌肉枯，气道涩，五脏之气相搏，其营气衰少，而卫气内伐^[22]”。 张从正曰:“脾主运化，胃主消腐，总以通畅为贵，一有积滞，诸症峰起”。《灵枢·天年篇》曰：“其不能终寿而死者，五藏皆不坚，使道不长……，薄脉少血，其肉不实，数中风寒，血气虚，脉不通，真邪相攻，乱而相引，故中寿而尽也^[23]”。这里明确指出，老者由于五脏不坚，气血虚弱，导致肌肉枯、气道涩、脉不通、使道不长，进而营气衰少，卫气内伐，稍感外邪即病，不尽天年而终。其中“气道涩，脉不通”指的气滞血瘀；“使道不长”指五脏所发挥作用的道路不通畅，使气血津液循行、运化、疏泄的过程失常，致瘀滞形成，阻碍生理活动的正常进行，从而使脏腑器官、四肢百骸失养，而导致衰老，即菀陈瘀滞的积蓄是形成衰老的重要原因。既然菀陈瘀滞的形成是衰老的重要原因，且许多老年病均与其积蓄有关，故而去菀陈瘀滞就成为防治老年病、延缓衰老的重要方法。正如《中藏经》所云：“其本实者，得宣通之性必延其寿 ^[24]。《灵枢·九针十二原》云：“虚则实之，满则泄之，菀陈则除之^[25]”。《灵枢·小针解》又进一步解释曰：“菀陈则除之者，去血脉也^[26]”。这里讲的虽是针刺的方法，却提示了通利以去菀陈的治则。“气血冲和，百病不生”，只有除菀陈积滞，使脏腑经络气血通畅无阻，才能达到延年衰老之目的。

祖国医学认为大黄具有泻下攻积、清热泻火、止血、解毒、活血祛瘀等作用。《神农本草经》谓其“下瘀血、血闭寒热，破癥瘕积聚、留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏^[27]”。《罗氏会约医镜》云：“大黄能除肠胃燥结、宿食、瘀血。主……癥瘕积聚，消痈肿，化痞满，通二便，损伤积血，……^[28]”。《古今医鉴》云：“大黄夺土将军，逐滞通瘀，下胃肠结热 ^[29]”。《汤液本草》云：“大黄，……，泄满，推陈致新，去陈垢而安五脏^[30]”。《本草求真》云：“……一切癥瘕血燥，血秘实热等证，用此皆能推陈致新，定乱致治 ^[31]”。大黄苦寒，苦能泻，寒能清，推陈致新，使腑气通，纳化健，中气调畅，又能破热结，行瘀滞，使气血流通，俾腑气得通，气血得运，去菀除陈，则五脏安和矣。诸家论述为大黄延缓衰老的重要地位奠定了理论基础。

2   大黄延缓衰老作用的现代研究进展

现代研究证实，从波叶大黄中提取的波叶大黄多糖（RHP）0.2％或0.1％浓度均能显著延长两性果蝇成虫的平均寿命和最高寿命，与对照组相比，0.2％RHP组果蝇平均寿命分别延长41.9％（雌）和48.8％（雄），最高寿命分别延长60.6％（雌）和64.7％（雄）；0.1％RHP组果蝇平均寿命分别延长24.7％（雌）和12.8％（雄），最高寿命分别延长37.9％（雌）和55.9％（雄）^[32]；常饮大黄水的骆驼寿命比一般骆驼可多活5年以上，常饮大黄水的牧驼人有长寿倾向^[33]；大黄水提物对小鼠肝匀浆过氧化脂质生成具有明显的抑制作用^[34][35]；大黄能清除O₂˙、H₂O₂和其他活性氧是一种有效的抗氧化剂^[36]，其抗超氧负离子活性顺序为华北大黄>河套大黄>唐古特大黄、掌叶大黄、药用大黄、藏边大黄^[37]；大黄水煎液可显著增强小鼠血中超氧化物歧化酶（SOD）^[38][39]、谷胱甘肽过氧化物（GSH－Px）活性（P<0.05～0.01），而且这种作用在一定范围内有随大黄用量增加而加强趋势，这说明大黄具有延缓衰老的作用^[40]，并能明显降低小鼠脑中B型单胺氧化酶（MAO－B）的活性^[41]；口服不同剂量大黄水煎液，均具有促进小鼠的牛血清白蛋白诱导的迟发型超敏反应及细菌脂多糖（LPS）和刀豆蛋白A（ConA）对脾细胞的增殖反应，说明大黄具有促进小鼠细胞免疫和淋巴细胞增殖的作用^[42]；ig 波叶大黄多糖（RHP）100和200mg/kg能明显增加小鼠脾脏和胸腺重量，与对照组相比，脾指数分别增加30％和38％，200mg/kg的剂量可使吞噬指数增加155％；能促进小鼠碳粒廓清速率，K值分别比对照组增加48％和217％；能促进SRBC致敏小鼠血清溶血素形成，HC₅₀（半数溶血值）分别比对照组增加11％和57％；能促进小鼠抗体形成细胞的生成，QHS（脾细胞介导红细胞溶血分光光度计测定法）分别比对照组增加63％和126％。RHP还可明显促进受Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞DNA的合成，最适浓度为20μg/ml，刺激指数为1.61；对Con A活化的脾淋巴细胞蛋白质合成也有明显促进作用，刺激指数为1.15；对Con A诱导的淋巴细胞IL－2产生有明显增强作用^[43]。

20世纪初期，梅契尼科夫^[44]提出自体中毒学说，该学说认为人体肠道中所寄居的细菌，尤其是大肠杆菌，在代谢中会产生大量的毒物，如吲哚、吲哚乙酸等。这些毒物被吸收后会导致机体慢性中毒,从而促成衰老。而便秘则无疑会加重这些有毒物质的吸收。他建议用酸牛奶等发酵制品,以便引入大量的乳酸杆菌,抑制大肠菌群产生毒素,从而减缓自体中毒。之后，里卡尔又补充了代谢过程中也可产生毒素，如细胞代谢可产生胺、酮体、二氧化碳等，这些有毒的代谢产物如果积聚，也可使机体中毒，导致衰老或死亡，进一步完善了此学说。大黄具有泻下作用^[45]，能减少肠道内有毒代谢产物，此亦是延缓衰老的重要途径。其保肝^[46]、降脂^[47][48]、抑制血管平滑肌细胞增殖^[49]等作用也有利于对衰老的防治。此外，大黄中含有多种微量元素如锰、锌、铁、钙、镁、铜、硒、镍、钠、锶、铬、铷、锗等^[50]，钙、镁、锰、硒、锌、锶、铬、铷是具有延缓衰老作用的微量元素^[51]，这些微量元素对于人体进行生理活动，是极其重要的^[52]。

3   衰老与自由基

衰老是生命过程中正常的生理现象和病理反应，是机体内各种生化反应的综合过程，其机理较为复杂，一直为老年学、老年医学、老年社会学以及生物学研究的前沿。近年来，各国学者在延缓衰老的研究中取得了许多突破性的进展，并相继提出了200余种衰老学说，其中自由基学说是人类衰老机理现代理论中有代表性的学说之一。

自由基学说是英国学者Denham Harman于1956年首先提出来的。其中心内容是“自由基反应普遍存在于生命有机体中，而且自由基是具有高度化学活性的中间体，衰老来自于正常代谢过程中产生的自由基的随机而破坏性的作用^[53]”。

自由基（free radical）或称游离基，是指在原子的外层轨道上具有未配对电子的原子、原子团、特殊状态的分子或离子。通常在原子符号的后面或前面加一个小圆点，以表示非配对电子。它是一类具有高度活性的物质，在正常的生命过程中为维持生命所必需的，但自由基也是生物大分子、细胞和生物组织的危险的杀手^[54]，可直接或间接的发挥其强氧化剂作用，从而损伤生物体的大分子和多种细胞成分。超氧阴离子自由基（O₂˙）、羟自由基（˙OH）、氢过氧基（HO₂˙）、烷氧基（RO˙）、烷过氧自由基（ROO˙）、酰氧自由基（RCOO˙）、脂质氢过氧化物（ROOH）等含氧的活性物质都具有较氧活泼的化学活性，统称为活性氧，其中O₂˙、˙OH、HO₂˙、RO˙、ROO˙属氧自由基。大多数自由基是不稳定的，存在的时间很短，但由于其化学性质极其活泼，所以作为反应中间物在生物体内起着重要作用。

在机体正常的代谢过程中，如细胞呼吸作用和线粒体内的氧化过程均能产生超氧阴离子自由基、H₂O₂、羟基自由基(˙OH)、单线态氧(¹O₂)等许多自由基。机体内除自由基途径有两条：一条是通过天然抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）等一系列以不同基质特异性组成的一个多水平的还原自由基及氢过氧化物系统；另一条是通过天然抗氧化剂途径，如维生素E、维生素C，辅酶Q等，使自由基变成不活泼的分子，而自身比较稳定。SOD、CAT、GSH－Px是机体清除自由基的主要抗氧化酶，它们的活性随着年龄的增长而下降，测定它们的活性可以比较全面的反映机体抗氧化能力。在生理情况下，机体自由基的产生与清除处于动态的平衡之中，不会造成危害。由于某些生理作用或生化反应中需要O₂˙和˙OH等参与，机体还要通过自由基的产生与消除来维持有利无害的、生理性低水平的、稳定平衡的自由基浓度^[55]。但在病理情况下，自由基的产生与清除失去了平衡，不论其原因是自由基的产生增加，还是机体清除自由基的能力减弱，或者两者兼而有之，其后果是大量自由基不能完全被防御系统所清除，就会在体内积累，引起生物大分子如脂质、蛋白质、核酸的损伤，导致细胞结构的破坏和机体的衰老^[56]。O₂˙不仅本身是性质活泼的自由基，而且是导致自由基连锁反应的启动者，促使其它类型自由基的生成。越来越多的实验和临床观察表明，O₂˙是许多生理和病理过程的参与者，许多疾病的发生及转归直接或间接与自由基有关。目前，在生物、物理、化学、医学等领域内，有关O₂˙的研究相当活跃。

4   大黄酚和大黄素甲醚提取方法探讨

大黄酚和大黄素甲醚结构相似，酸性与极性相近，分离工作较为困难。文献报道用纤维素粉柱层析^[57]、硅胶柱层析^[58][59]分离，但纤维素粉柱层析操作较麻烦且样品上柱量少；硅胶柱层析样品上柱量较大，但因使用两种洗脱剂，溶剂消耗量大。我们通过实验反复摸索后发现将所分离的大黄酚和大黄素甲醚混合物用单一洗脱剂进行柱层析分离，亦能较好的分离大黄酚和大黄素甲醚混合物。

本提取方法的优点：（1）本方法较文献报道的方法样品上柱量大，溶剂单一，可反复套用，节省溶剂，样品分离效果好；（2）分液漏斗为改进后的分液漏斗，可以最大限度的减少洗脱剂的挥发，且干净；（3）该方法适合基层制备标准品选用，因洗脱液的合并与否不需检测，只需查看成分在吸附柱上的不同颜色即可。

5   国内对中药降自由基和ESR的研究状况

近年来，我国和几个发达国家的人口相继出现了老龄化问题，人口的老龄化日益成为一个严重的社会问题。鉴于衰老问题是一个复杂而微妙的生命过程，在长期研究过程中，从不同侧面探索生命衰老过程中形成了衰老的有害物质累积学说、内分泌功能减低学说、器官功能减退学说、衰老的免疫学说、大分子交联学说、微量元素学说、衰老的基因学说、衰老的分子生物学、衰老的膜假说、衰老的细胞分化障碍假说以及衰老的自由基学说。根据自由基理论，从深入地探讨这些学说理论的机制来考虑，自由基在上述学说中都起着不可缺少的启动、介导作用，甚至自由基反应就是上述学说的组成部分^[60]。

据报道^[61]许多延缓衰老中药可通过清除自由基，从而达到延缓衰老的目的。自由基清除剂正广泛的应用于衰老及老年病的防治。探索自由基的代谢规律和筛选合宜的天然药物进行调治，已成为当前医学界研究的热点。目前延缓衰老中药研究方法主要有：一、自由基测定方法；二、氧化性代谢产物测定方法（包括脂质过氧化物测定、氢过氧化脂质测定、脂褐质测定）；三、抗氧化酶活性测定方法（包括超氧化物歧化酶测定、超氧化物歧化酶同工酶测定、过氧化氢酶测定、过氧化物酶测定、谷胱甘肽过氧化物酶测定）；四、老化相关酶测定方法（包括单胺氧化酶测定、Na⁺，K⁺－ATP酶测定）；五、核酸蛋白测定方法（包括DNA、RNA含量测定、蛋白质含量测定、胶原蛋白含量测定）^[62]。自由基的测定方法有电子自旋共振波谱法、高效液相电化学检测法、化学发光法和分光光度法等，其中电子自旋共振波谱法是普遍推崇的测量自由基的方法。电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）也称电子自旋共振（electron spin resonance，ESR），这两个名称在当今国际文献中并行通用。ESR法操作简便，测量快速，精确度及灵敏度较高，不论是直接检测或通过自旋捕集间接检测都是特异性的。它是利用待测样品中存在未配对的电子，具有带电、自旋及磁偶极距的特点，在外磁场中，电子的自旋磁矩对外加磁场呈现两种取向：一种是电子磁矩方向与外磁场方向相同，它的能量值较原平均值减少；另一种是电子磁矩方向与外磁场方向相反，能量较高。其相应能量分别为－1/2gΒH和1/2gΒH，其中g一般称为g因子，也称光谱分裂因子，表征电子的自旋角动量与其轨道角动量对分子磁矩的相对贡献；β是电子的波尔磁子；H为外加磁场。在垂直H的方向，再加一高频磁场，使其频率为V，此时，低能级的未配对电子则从高频磁场吸收能量跃迁至高能级，这就产生电子能与辐射场共振。将这种能量吸收转变为电信号，进行检测、放大，则得到ESR波谱信号。ESR谱仪所能检出的自由基的绝对浓度约在10^－8M数量级左右。一般不需要对样品进行复杂的处理，可拿来直接测定。检测后样品不受破坏，对样品自身反应无干扰。对同一样品可以反复测量。可以追踪反应过程中顺磁粒子的形成、消失、再生和转移，阐明反应的机制和动态过程^[63]。

有关 O₂˙的产生及其检测方法的研究基本上都是通过对超氧化物歧化酶活性的测定，间接的推论O₂˙的存在，而采用电子自旋共振（ESR）法^[64]直接观察O₂˙产生的动力学过程的工作则较少。用ESR法直接观察O₂˙信号的变化，并以此评估中药对O₂˙的增抑作用虽已有报道，但从大黄中提取单体的化学成分进行ESR研究，以观察其清除O₂˙能力的研究尚未见文献报道。

在实验条件下，ESR的测量必须在低温下进行，DMSO体系中会产生稳定的超氧阴离子自由基O₂˙，其ESR信号如附图20所示。由附图20测得ESR信号的各向异性因子g为：g_//＝2.1015，g_＝2.0078，该信号是O₂˙存在的表征，上述参数与文献报道的O₂˙的特征参数一致^[20][65]。因此，可用g_的信号幅度作为O₂˙产物的相对浓度。O₂˙的ESR信号强度与测定幅度有关，温度越低，信号越强。我们根据实验的操作条件，选择77K为测定温度，实验结果表明，在此温度下产生O₂˙的反应不再进行，这为在同一温度条件下充分研究DMSO体系产生O₂˙的变化提供了有利条件。另外，在DMSO碱性反应体系中，O₂˙的生成量与NaOH的浓度C_NaOH有关，为得到一个既稳定、又有利于检测的反应体系，经过反复摸索我们发现C_NaOH浓度以10mmol/L较为适宜。

众所周知，中药材由于产地、采收季节、加工及炮制方法的不同，而使同种药材所含有效成分差异较大，所含有效成分含量亦不同。杨氏等^[66]采用HPLC法对不同产地大黄中大黄酸的含量进行比较，结果唐古特大黄含大黄酸最多。药物由于提取方法不同，所提取化学成分及浓度亦不同，发挥的作用不一样，随着药液浓度的变化，在反应体系中作用的主从地位可能发生着变化，况且多种成分共存时，有时还可能发生协同或拮抗效应。结果启示我们，服用中药时，亦存在药物剂量问题，即使同一药物，浓度不同也会产生不同的效果。因此我们认为采用ESR法观察中药清除O₂˙作用，应从中药材中提取其单体成分进行实验，实验结果才能比较客观、准确的反应其清除作用。

中医药的抗氧化作用虽然可分为清除氧自由基及抑制氧自由基产生两个方面，但是，由于中药复方制剂甚至单味中药，其有效成分具有多样性特点，因此，其抗氧化作用的作用机制常常是两方面同时具备。从目前中药抗氧化的研究报道来看：尽管不乏高水平、高难度的研究，但确实也有一些研究还停留在不太高的层次上，存在着同一水平重复研究的问题。目前应加强量效关系方面的研究；从粗提物的研究向分离单体的研究过渡；从单味药的研究向进行复方的研究过渡，从而使中医药抗氧化的研究跨上一个新台阶。

全 文 结 语

CONCLUSION

黄中提取的主要成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚均具有一定清除O₂˙的能力，大黄所具有的延缓衰老的作用，可能与其所含的主要成分清除超氧阴离子自由基（O₂˙）而起到抗氧化的作用有关，该结果为大黄延缓衰老的作用提供了理论依据，并为课题“大黄腹膜透析液”降自由基的作用提供理论依据。本实验将对大黄的传统认识和现代研究有机的结合了起来，为从天然产物中寻觅延缓衰老的有效药物提供了一条较为简捷的途径。但本实验是在体外模型中进行的，与复杂的体内环境不同，其需要考虑在病理状态及生理状态的不同情况下中药的抗氧化特性的异同，如pH值、电解质浓度、温度以及各种酶的存在等，因此，要了解大黄的主要成分在体内对自由基的清除情况，尚需进一步研究，从而进一步明确其抗氧化作用的机制，推动中药的现代化研究。

参考文献

[1] 李秀才．大黄的研究进展．中国药学杂志（J），1998，33（10）：581～584．

[2] 张秋菊，张长伟，江骏，等．大黄水提物的促智作用研究．中药材（J），2001，24（10）：728～730．

[3] 桑雁，韩清，王宪波，等．大黄抗衰老作用的实验研究．新乡医学院学报（J），1996，13（1）：13～15．

[4] 田金洲，杜怀棠，杨惠民，等．复方大黄制剂改善老年人记忆功能的临床研究．中医杂志（J），1995，36（9）：545～547．

[5] 肖华山，傅文庆，赵保路，等．大黄提取液对体外氧自由基清除作用的研究．福建师范大学学报（自然科学版）（J），1993，9（4）：68～72．

[6] 陈季武，胡天喜．大黄清除活性氧的作用．中国药学杂志（J），1996，31（8）：461～463．

[7] 陈可冀，李春生.新编抗衰老中药学（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，1998．352． 

[8] 方文贤，刘萍，王巍，等．实用临床抗衰老中药（M）．第1版．沈阳：辽宁科学技术出版社，2002：9～11．

[9] 耿德章．中国老年医学（上册）（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，2002．17～21．

[10] 张洪泉，余文新．中华抗衰老医药学（M）．第1版．北京：科学出版社，2000．7．

[11] 田清涞，李云兰．酶与衰老．老年学杂志（J），1993，13（6）：372～374．

[12] 苗明三，李振国．现代实用中药质量控制技术（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，2000．66～68．

[13] 袁倬斌，尚小玉．大黄中有效成分的提取、分离测定及其抗突变作用．分析科学学报（J），2002，19（6）：508．

[14] 梁光义．中药化学（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，1998．70．

[15] 杨云，张晶，陈玉婷．天然药物化学成分提取分离手册（M）．第2版．北京：中国中医药出版社，2003．33．

[16] 杨云，张晶，陈玉婷．天然药物化学成分提取分离手册（M）．第2版．北京：中国中医药出版社，2003．34．

[17] 国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）（M）．2000年版．北京：化学工业出版社，2000．附录Ⅵ B．

[18] 陈德昌．中药化学对照品工作手册（M）．第1版．北京：中国医药科技出版社，2000：42～47．

[19] 陈德昌．中药化学对照品工作手册（M）．第1版．北京：中国医药科技出版社，2000：97～98．

[20] Knowles PF, Gibson JF, Pick FM,etc．Electron-spin-resonance evidence for enzymic reduction of oxygen to a free radical, the superoxide ion.Biochem J（J）．1969，111（1）：53～58．

[21] 程士德．内经讲义（M）．第1版．上海：上海科学技术出版社，1984．46．

[22] 张珍玉．灵枢经语释（M）．第1版．济南：山东科学技术出版社，1983．209．

[23] 张珍玉．灵枢经语释（M）．第1版．济南：山东科学技术出版社，1983．447．

[24] 李聪甫．中藏经校注（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，1990．95．

[25] 张珍玉．灵枢经语释（M）．第1版．济南：山东科学技术出版社，1983．5．

[26] 张珍玉．灵枢经语释（M）．第1版．济南：山东科学技术出版社，1983．37．

[27] 马继兴．神农本草经辑注（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，1995．338．

[28] 清·罗国纲．窦钦鸿，曲京峰点校．罗氏会约医镜（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，1965．586．

[29] 明·龚信纂辑，龚廷贤续编．王立，陶晓华，吴跃进校注．古今医鉴（M）．第1版．南昌：江西科学技术出版社，1990．26．

[30] 元·王好古．崔扫尘，尤荣辑点校．汤液本草（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，1987．95．

[31] 清·黄宫绣．席与民，朱肇和点校．本草求真（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，1987．163．

[32] 郭澄，张纯．大黄抗衰老作用的研究概况．中医药信息（J），1996，（3）：24．

[33] 何天有，赵亦工．大黄抗衰老作用初探．中医药研究（J），1991，（4）：49～50．

[34] 梁嵘，杨维益．大黄抗衰老作用探讨——大黄对小鼠肝匀浆过氧化脂质的影响．天津中医（J），1988，(6)：21～22．

[35] 吴英良，曹颖林，时向群，等．大黄对小鼠肝脏脂质过氧化的抑制作用．中国中药杂志（J），1996，21(1)：240～241．

[36] 陈季武，胡天喜．大黄清除活性氧的作用．中国药学杂志（J），1996，31（8）：461～463．

[37] 郑俊华，楼之岑，史录文，等．大黄抗超氧负离子自由基的活性研究．北京医科大学学报（J），1989，21（5）：436．

[38] 桑雁，韩清，王宪波，等．大黄抗衰老作用的实验研究．新乡医学院学报（J），1996，13（1）：14．

[39] Lu－Wen Shi，Chun－Su Lu，Jun－Hua zheng，etc．SOD－like Activities of Fifteen Constituents from Rhubarb．Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences（J），l992，1(2)：59～64．

[40] 桑雁，韩清，王宪波，等．大黄抗衰老作用的实验研究．新乡医学院学报（J），1996，13（1）：15．

[41] 姚文兵，高向东，周慧萍，等．大黄的生化学研究XXXVI．波叶大黄多糖抗衰老作用的实验研究．中国药科大学学报（J），1991，22（3）：168．

[42] 马路，侯桂霞，顾华，等．大黄免疫调节作用的实验研究．中西医结合杂志（J），1991，（7）：418．

[43] 姚文兵，陈琼华．大黄的生化学研究XXXI．波叶大黄多糖对免疫功能的促进作用．中国药科大学学报（J），1990，21（2）：99～102．

[44] 耿德章．中国老年医学（上册）（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，2002．17．

[45] 赵燕玲，张仲海，王宗仁，等．大黄的泻下作用与肠道5－HT及其受体的关系．云南中医学院学报（J），2002，25（1）：1．

[46] 林秀珍，马德禄，崔荣芬．大黄素及番泻甙和大黄多糖对培养大鼠肝细胞内流离钙浓度的影响．中国中西医结合杂志（J），1995，15（7）：419～421．

[47] 焦东海，杜上鉴，孙爱贞，等．大黄糖浆降脂作用的临床观察．中西医结合杂志（J），  1990，10(2)：110．

[48] 钱尚统，焦东海，杜上鉴．大黄冲剂治疗高脂血症35例．上海中医药杂志（J），1991，(6)：31．

[49] 郭丹杰，徐成斌，陈源源．大黄素对血管平滑肌细胞增殖影响的实验研究[J]．中华内科杂志, 1996，35（3）：157．

[50] 苗明三，李振国．现代实用中药质量控制技术（M）．第1版．北京：人民卫生出版社，2000．67～68．

[51] 颜世铭，洪昭毅，李增禧．实用元素医学（M）．第1版．郑州：河南医科大学出版社，2000．57．

[52] 杨永建，沈世林．甘肃大黄属14个分类群微量元素测定——原子吸收分光光度法．兰州医学院学报（J），1994，20（4）：233～234．

[53] Harman D．Aging:a theory based on free radical and radiation chemistry．J Gerontol（J），1956，11(3):298～300.

[54] 孙存普，张建中，段绍瑾．自由基生物学导论（M）．第1版．合肥：中国科学技术大学出版社，1999．2．

[55] 韩银淑．中草药在抗衰老中的应用．中国医学理论与实践（J），2002，（1）：99．

[56] Hagihara M, Nishigaki I, Maseki M, Yagi K. Age-dependent changes in lipid peroxide levels in the lipoprotein fractions of human serum. J Gerontol（J），1984，39(3):269～272.

[57] 阚毓铭．大黄酚和大黄素甲醚分离方法的研究．南京中医学院学报（J），1982，4（2）：37～39．

[58] 洪美芳．较大量分离大黄酚和大黄素甲醚的方法．南京中医学院学报（J），1985，（1）：49．

[59] 孙阳，陈琼华．大黄素甲醚和大黄酚制备性柱层析分离．南京药学院学报（J），1985，（1）：71～72．

[60] 方允中，郑荣梁．自由基生物学的理论与应用（M）．第1版．北京：科学出版社，2002．440．

[61] 吴伟．中药抗衰老与清除自由基损伤．新中医（J），1993，（2）：55．

[62] 张洪泉，余文新．中华抗衰老医药学（M）．第1版．北京：科学出版社，2000．357．

[63] 方允中，郑荣梁．自由基生物学的理论与应用（M）．第1版．北京：科学出版社，2002．926～927．

[64] Masahiro Kohno，Masako Yamada，Keichi．Mitsata，et．al．Spin-trap ping studies on the reaction of iron complexes with peroxides and the effects of water-soluble antioxidants．Bull chem．Soc Jpn（J），1991，64：1447．

[65] Hyland K,Auclair C．The formation of superoxide radical anions by a reaction between O₂˙，OH^－ and dimethyl sulfoxide．Biochem and Biophys Res Commun（J），1981，102(1)：531～537．

[66] 杨连菊，胡世林，李先端．不同产地大黄中大黄酸的含量比较．基层中药杂志（J），1994，8(2)：25～26．

大黄素 大黄提取物  就选上禾生物  大黄素50-98%