大黄素对大鼠急性胰腺炎的治疗作用 | 大黄素对大鼠急性胰腺炎的治疗作用 |
| 发布时间:2012-08-03 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:3325 |
大黄素对大鼠急性胰腺炎的治疗作用 【摘要】 目的 探讨大黄素诱导细胞凋亡对大鼠急性胰腺炎（ａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ＡＰ）的治疗作用。 方法 ４５只ＳＤ大鼠分为对照组、胰腺炎组、治疗组，每组１５只。观察胰腺组织内腺泡细胞凋亡指数、ＮＦκＢｍＲＮＡ、ＢａｘｍＲＮＡ、外周血中中性粒细胞（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ，ＰＭＮ）凋亡指数及天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶（ｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ８）的变化情况。结果 与胰腺炎组比较，治疗组腺泡细胞和ＰＭＮ 凋亡指数及胰腺组织内ＮＦκＢｍＲＮＡ、ＢａｘｍＲＮＡ、ＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３与ｃａｓｐａｓｅ８表达均明显增加（Ｆ＝８５３．１９９， ３２７．１２６，１４３．５８６，４８．８５７，２３１．７５０，９６．５５２，Ｐ＜０．０５）。治疗组中，胰腺组织病理学评分与胰腺腺泡细胞 凋亡指数、ＰＭＮ凋亡指数均呈负相关（ｒ＝－０．９６，－０．９４，Ｐ＜０．０５）；胰腺腺泡细胞凋亡指数与胰腺组织 内ＮＦκＢｍＲＮＡ、ＢａｘｍＲＮＡ表达呈正相关（ｒ＝０．７３，０．７６，Ｐ ＜０．０５）；胰腺组织内ＮＦκＢｍＲＮＡ与 ＢａｘｍＲＮＡ表达呈正相关（ｒ＝０．９４，Ｐ＜０．０５）；ＰＭＮ凋亡指数与ＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ８表达均呈正相 关（ｒ＝０．９９，０．９９，Ｐ＜０．０５）。结论 大黄素能有效治疗ＡＰ，其机制是通过Ｂａｘ途径诱导胰腺腺泡细胞 凋亡，并通过ｃａｓｐａｓｅ途径来诱导外周血中ＰＭＮ凋亡，从而明显减轻ＡＰ病情程度。 【关键词】 胰腺炎; 急性； 大黄素； 凋亡
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｅｍｏｄｉｎｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓｉｎｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＦｏｒｔｙｆｉｖｅＳＤ ｒａｔｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓｇｒｏｕｐａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｃｉｎａｒｃｅｌｌｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＦκＢｍＲＮＡａｎｄＢａｘｍＲＮＡ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ（ＰＭＮ），ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３ａｎｄＰＭＮｃａｓｐａｓｅ８ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓｇｒｏｕｐ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｃｉｎａｒｃｅｌｌｓａｎｄＰＭＮ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＮＦκＢｍＲＮＡ，ＢａｘｍＲＮＡ，ＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３ａｎｄＰＭＮｃａｓｐａｓｅ８ｉｎｐａｎｃｒｅａｓｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ（Ｆ＝８５３．１９９，３２７．１２６，１４３．５８６，４８．８５７，２３１．７５０，９６．５５２， Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｓｃｏｒｅｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘｏｆｔｈｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｃｉｎａｒｃｅｌｌｓａｎｄＰＭＮ（ｒ＝－０．９６，－０．９４，Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘｏｆｔｈｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｃｉｎａｒ ｃｅｌｌｓｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＦκＢｍＲＮＡ，ＢａｘｍＲＮＡｉｎｐａｎｃｒｅａｓｔｉｓｓｕｅ（ｒ＝０．７３，０．７６， Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＦκＢｍＲＮＡｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｏｆＢａｘｍＲＮＡ（ｒ＝０．９４，Ｐ＜０．０５）． ＴｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘｏｆＰＭＮｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３ａｎｄＰＭＮｃａｓｐａｓｅ８ （ｒ＝０．９９，０．９９，Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＥｍｏｄｉｎａｌｌｅｖｉａｔｅｓａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓｖｉａｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｃｉｎａｒｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈＢａｘｐａｔｈｗａｙ，ａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＰＭＮａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｃａｓｐａｓｅｐａｔｈｗａｙ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ａｃｕｔｅ； Ｅｍｏｄｉｎ； Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ 急性胰腺炎（ａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ＡＰ）是临床上常 见的急腹症之一，常伴全身炎症反应综合征或ＭＯＤＳ［１］。中药大黄对ＡＰ的治疗效果已经得到普遍认可，但作用机制尚不清楚［２－３］。本研究旨在以凋亡信号传导的原理来初步探讨大黄素治疗大鼠ＡＰ可能的分子生物学机制。 １ 材料与方法 １．１ 动物分组和模型制备 ４５只ＳＤ大鼠购自南通大学实验动物中心，雌雄不限，体质量２５０～３００ｇ。实验前１２ｈ禁食不禁水。分为３组，每组１５只。对照组：剖腹探查；胰腺炎组：３％戊巴比妥腹腔注射麻醉，逆向穿刺胰胆管缓慢注射３．５％牛磺胆酸钠，建立大鼠ＡＰ模型。治疗组：建立大鼠ＡＰ模型，开腹后经小肠穿刺给予大黄素２．５μｇ／ｇ（南京建成生物研究所）。建立模型后对照组大鼠无死亡，胰腺炎组死亡４只，治疗组死亡２只。各组存活大鼠中选取１０只作为研究对象。 １．２ 检测方法 建立模型后１２ｈ开腹，腹主动脉采全血５ｍｌ，离心后待测，同时无菌条件下取胰腺组织。碘淀粉比色法测定血清淀粉酶；ＥＬＩＳＡ法测定血清ＴＮＦα；ＴＵＮＥＬ法检测腺泡细胞凋亡情况。凋亡指数：选择４个高倍镜视野，每个视野中计算２５０个腺泡凋亡细胞数；组织病理学评分标准按改良Ｓｃｈｍｉｄｔ法［４］进行；ＲＴＰＣＲ法检测胰腺组织内ＮＦκＢｍＲＮＡ、Ｂａｘ ｍＲＮＡ的表达；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测外周血中中性粒细胞（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ，ＰＭＮ）ｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ８的表达；流式细胞仪分析腺泡细胞凋亡情况：ＡｎｎｅｘｉｎＶ阳性为凋亡细胞，ＰＩ阳性为坏死细胞，ＡｎｎｅｘｉｎＶ和ＰＩ双阳性为凋亡晚期或坏死细胞。 １．３ 统计学分析 应用Ｓｔａｔａ７．０统计软件进行分析。数据用珋ｘ±ｓ表示，数据间比较采用方差分析，两两比较采用ＳＮＫｑ检验，两者间相关关系采用直线相关分析。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２ 结果 ２．１ 各组大鼠血清淀粉酶和ＴＮＦα及组织病理学 评分情况 胰腺炎组和治疗组血清淀粉酶、ＴＮＦα表达较对照组明显升高，但治疗组各项指标均较胰腺炎组低（表１，图１）。 ２．２ 各组大鼠腺泡细胞及外周血中ＰＭＮ凋亡情况 治疗组腺泡细胞和外周血中ＰＭＮ凋亡指数均较胰腺炎组明显升高（表２，图２）。 ２．３ 各组大鼠胰腺组织内ＮＦκＢｍＲＮＡ和Ｂａｘ ｍＲＮＡ以及外周血中ＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３和ｃａｓｐａｓｅ８的表达情况 治疗组胰腺组织内ＮＦκＢｍＲＮＡ、ＢａｘｍＲＮＡ及外周血中ＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ８的表达均较胰腺炎组明显升高（表３）。 ２．４ 治疗组大鼠各检测指标间的相关分析 胰腺组织病理学评分与腺泡细胞凋亡指数、外周血中ＰＭＮ凋亡指数均呈负相关（ｒ＝－０．９６，－０．９４，Ｐ＜０．０５）；腺泡细胞凋亡指数与胰腺组织内ＮＦκＢｍＲＮＡ、ＢａｘｍＲＮＡ表达呈正相关（ｒ＝０．７３，０．７６，Ｐ ＜０．０５）；胰腺组织内ＮＦκＢｍＲＮＡ与ＢａｘｍＲＮＡ表达呈正相关（ｒ＝０．９４，Ｐ＜０．０５）；外周血中ＰＭＮ凋亡指数与ＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ８表达均呈正相关（ｒ＝０．９９，０．９９，Ｐ＜０．０５）。
３ 讨论 ３．１ 大黄素对ＡＰ的治疗作用 本研究结果显示：与胰腺炎组比较，治疗组腺泡细胞凋亡明显增多，其腺泡细胞凋亡指数与组织病理学评分呈负相关。同时我们还发现，治疗组可诱导外周血中ＰＭＮ凋亡，且ＰＭＮ凋亡指数亦与组织病理学评分呈负相关。因此，我们认为ＡＰ病程中可能同时存在腺泡细胞凋亡和外周血中ＰＭＮ凋亡两种状况，设法诱导细胞凋亡对治疗ＡＰ具有重要价值。
３．２ 大黄素诱导细胞凋亡治疗ＡＰ的可能机制 大黄素诱导凋亡机制主要通过非受体途径，即Ｂａｘ和ｃａｓｐａｓｅ８等分支途径实现［５］。然而，大黄素诱导凋亡的一些中间环节仍未完全明了。本实验研究发现，胰腺组织内ＢａｘｍＲＮＡ表达与其腺泡细胞凋亡指数呈正相关，提示Ｂａｘ途径在大黄素治疗ＡＰ中发挥重要作用。治疗组大鼠胰腺组织内ＮＦκＢｍＲＮＡ的表达较胰腺炎组显著升高，且与ＢａｘｍＲＮＡ表达呈正相关，提示ＮＦκＢ也参与了大黄素诱导腺泡细胞凋亡。由此，我们推测大黄素治疗ＡＰ时，促进了腺泡细胞内ＮＦκＢ的产生和活化。而作为重要的基因调控因子，ＮＦκＢ在Ｂａｘ等基因的启动子上有结合位点并调控其表达，随着ＮＦκＢ基因表达活性增强，Ｂａｘ基因表达活性亦增强。促凋亡基因Ｂａｘ表达上调，必然使腺泡细胞凋亡增加，减轻胰腺炎病情。因此，大黄素诱导腺泡细胞凋亡机制的Ｂａｘ途径中，ＮＦκＢ可能就是大黄素－Ｂａｘ中间环节的待确定因素。 既往研究发现，ＰＭＮ凋亡主要由ｃａｓｐａｓｅ介导。本研究发现治疗组大鼠外周血中ＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ８表达较胰腺炎组明显升高，且治疗组大鼠外周血中ＰＭＮｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ８表达与ＰＭＮ凋亡指数呈正相关。这提示在ＡＰ病程中，大黄素可诱导外周血中ＰＭＮ的凋亡，其诱导凋亡机制可能与ｃａｓｐａｓｅ分支途径关系密切。 综上所述，我们认为大黄素对ＡＰ的治疗作用是多层面的，除了通过诱导胰腺腺泡细胞凋亡减轻胰腺局部病理损伤外，还可能通过诱导外周血中ＰＭＮ凋亡发挥治疗ＡＰ的作用。 参考文献 ［１］ 周新泽，郝磊，毛勤生．从全身炎症反应综合征角度评判急性 胰腺炎预后及其临床价值．中国现代医学杂志，２００７，１７（４）： ４５４－４５７． ［２］ 周黎明，万莉红，李贵星，等．大黄素对大鼠急性坏死型胰腺炎 的干预作用．中药药理与临床，２００６，２２（２）：１５－１６． ［３］ 李敬东，李波，刘续宝，等．重症急性胰腺炎的中西医结合治 疗．消化外科，２００３，２（５）：３５０－３５３． ［４］ ＳｃｈｍｉｄｔＪ，ＬｅｗａｎｄｒｏｗｓｉＫ，ＷａｒｓｈａｗＡＬ，ｅｔａｌ．Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａｎｄｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙｏｆａｎｅｗｍｏｄｅｌｏｆａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ ｉｎｔｈｅｒａｔ．ＩｎｔＪＰａｎｃｒｅａｔｏｌ，１９９２，１２（１）：４１－５１． ［５］ ＬｅｅＨＺ．Ｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｅｍｏｄｉｎｏｎｃｅｌｌｉｎｈｕｍａｎｌｕｎｇ ｓｑａｍｏｕｓｃｅｌｌ．ＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２００１，１３４（１）：１１－２０．
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