【摘要】  目的：通过去卵巢大鼠骨质疏松模型，研究杜仲叶醇对骨密度和血清雌激素、IL-6水平的影响。方法：切除雌性Wistar大鼠双侧卵巢建立骨质疏松动物模型，给予杜仲叶醇灌胃，治疗12周后，检测大鼠骨密度、血清雌激素、IL-6水平。结果：去势后大鼠骨密度降低，采用杜仲叶醇治疗后骨密度、血清雌二醇（E2）含量显著升高（P<0.05），IL-6水平显著下降（P<0.05）。结论：杜仲叶醇可显著提高去势大鼠骨密度和血清雌激素水平，对血清IL-6水平有抑制作用。

　　【关键词】  骨质疏松 实验性/药物疗法 骨密度/药物作用 雌二醇 IL-6 杜仲/类似物衍生物 杜仲/治疗作用 杜仲叶醇   杜仲提取物   杜仲叶提取物  杜仲绿原酸  杜仲叶绿原酸 上禾生物绿原酸 上禾生物杜仲提取物

　　　　(Department of endocrinology of the first affiliated hospital of Xinxiang Medical College, Henan 453100, China)

    【Abstract】  Objective：To study the effect of Duzhongyechun on the bone mineral density of rats without ovaria and the level of estrogen, IL-6 in serums through the osteoporosis models of the rats. Methods:Reproduce the osteoporosis model of ovariectomized Wistar rats and receive Duzhongyechun therapy. After 12 week therapy bone mineral density, serum estrogen and IL-6 were measured.Results: The bone mineral density of ovariectomized rats decreased significantly. Compared with the model group, the bone mineral density and the content of serum estrogen (E2) increased significantly（P<0.05）, the content of serum IL-6 decreased remarkably （P<0.05）after 12 week therapy using Duzhongyechun.Conclusions: Duzhongyechun can notably increase the bone mineral density and the content of serum estrogen of rats without ovaria, control the levels of IL-6 in serum.

    【Key words】Osteoporosis; Experimental/Pharmacotherapy; Bone mineral density/Drug action; Estrogen; IL-6; DuZhong/Analogue derivative; Duzhong/Therapeutic action; Duzhongyechun;  Rats
      
　　传统中药杜仲具有“补肝肾，坚筋骨”作用，是名贵滋补药，本实验通过去卵巢大鼠骨质疏松模型，观察杜仲叶醇提物对去势大鼠股骨线密度、面密度、骨干直径和血清雌二醇、IL-6水平的影响，现报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物

　　普通级Wistar大鼠48只，体重280～320 g，雌性，购于河南省实验动物中心，随机分成4组，每组12只，即正常对照组、模型对照组、西药尼尔雌醇对照组、杜仲叶醇提物治疗组，常规颗粒饲料喂养，自由饮水。

　　1.2  药品

　　1.2.1  杜仲叶醇提物制备

　　取新鲜杜仲叶5 kg，切细，在60 ℃条件下烘干后用水煎煮，待药液浓缩到1：1浓度时分两次递进加入浓度为60%、80%的乙醇，进行2次醇沉处理，滤液于水浴上蒸发，待乙醇挥发干净后，用缓冲液调节PH值到7.0，再用蒸馏水稀释至每ml含1g生药，滤清后于10磅/平方时压力下灭菌30分钟，然后放置到4℃冰箱中保存备用。

　　1.2.2  尼尔雌醇（nilestriol，CEE3），化学名3-环戊醚，北京四环制药二厂合格产品。

　　1.3  主要试剂及仪器

　　Rat ELISA IL-6试剂盒由美国ENDOGEN试剂公司生产，中国科学院上海原子核研究所生产的雌二醇放免分析试剂盒，中国原子能科学研究院生产的BMD 400E型骨密度扫描仪，中国科学院上海原子核研究所生产的FMJ-182放射免疫计数器，CODA全自动酶免分析仪：由美国BIO-RAD公司制造。

　　1.4  模型制作方法

　　模型对照组、西药对照组、杜仲叶醇提物组用戊巴比妥钠麻醉（40 mg/kg，腹腔注射），下腹部剪毛，消毒后剪开约1.5 cm的正中切口，行双侧卵巢结扎切除术，逐层缝合，术后肌注青霉素预防感染。正常对照组除未行卵巢结扎切除，而取腹腔内左右各一块脂肪外，其余步骤同前。

　　1.5  给药途径

　　西药对照组给予尼尔雌醇1.5 mg/kg，每周灌胃1次，其余6天灌等量蒸馏水；杜仲叶醇提物组给予杜仲叶醇提物生药6 g/kg。次灌胃，每日1次。每周按大鼠的公斤体重校正给药剂量，共12周；正常对照组和模型对照组给予等量蒸馏水灌胃。

　　1.6  标本采集及测定方法

　　1.6.1  实验结束，以1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，剖开鼠腹，从后腔静脉采血，离心取血清，每份血清分装2～3个冷冻管中，每管1～2 ml，置-80 ℃低温冰箱保存，待用。剥离双侧股骨，剔除附着的软组织，用10%福尔马林固定，用BMD 400E型骨密度扫描仪测量股骨中、上段1/3处1 cm范围内的线密度（BWD）、面密度（BMD）和骨干直径（BD）。

　　1.6.2  检测血清中雌二醇（E2）的含量

　　采用放射免疫法，按试剂盒说明书进行操作。

　　1.6.3  检测血清中IL-6的含量

　　采用夹心法ELISA检测，步骤如下：

    (1)包被

　　将稀释好的包被抗体加入Elisa板100 μl/孔，4 ℃放置48小时。

    (2)加待测标本

　　洗涤液冲洗Elisa板3次，加待测样品，阴性对照组及倍比稀释的标准品，100 μl /孔，37 ℃ ，1小时。标准品稀释方法：取标准IL-6，先用稀释液做4倍稀释，再倍比稀释为9个浓度：20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ ml和1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml， 0.078 ng/ml。

    (3)加酶标抗体
 
　　洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100 μl/孔37 ℃ ，1小时。

    (4)显色

　　洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100 μl/孔，室温或37 ℃，显色15～30分钟。

    (5) Elisa读数仪测410 nm处OD值，绘制标准曲线。

　　1.7  统计学处理

　　所测数据以均数±标准差（x±s）表示，两个样本均数的比较采用t检验。所有数据均采用SPSS 10.0统计软件进行处理，各项参数间比较，P<0.05为有统计学差异。

　　2  结果

　　2.1  各组大鼠股骨线密度、面密度和骨干直径测定结果（表1）

    从表1可见，与正常对照组比较，模型对照组大鼠股骨的线密度、面密度显著下降（P<0.05），骨干直径亦有下降趋势，但无统计学意义（P>0.05）；西药对照组的线密度、面密度和骨干直径不显著下降（P>0.05），杜仲叶醇提物组的线密度、面密度和骨干直径显著下降（P<0.05）。与模型对照组比较，西药对照组的线密度、面密度显著升高（P<0.05），骨干直径不显著升高（P>0.05），杜仲叶醇提物组的线密度、面密度显著升高（P<0.05），骨干直径不显著升高（P>0.05）。与西药对照组比较，杜仲叶醇提物组的线密度、面密度、骨干直径均降低，但无统计学意义（P>0.05）。表1  大鼠股骨线密度、面密度和骨干直径的变化(略)

　　2.2  各组大鼠雌二醇（E2）、IL-6含量测定结果（表2）表2  大鼠E2 、IL-6的变化(略)

    与正常对照组比较，模型对照组和杜仲叶醇提物组的大鼠血清E2均显著降低（P<0.05），西药对照组下降不显著；与模型对照组比较，西药对照组和杜仲叶醇提物组的大鼠血清E2显著升高。与正常对照组比较，模型对照组、西药对照组和杜仲叶醇提物组的大鼠血清IL-6含量均显著升高；与模型对照组比较，西药对照组和杜仲叶醇提物组的大鼠血清IL-6含量均显著降低；西药对照组和杜仲叶醇提物组的大鼠血清IL-6含量差异无显著性。

　　3  讨论

    绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis， PMO）是老年妇女常患的一种代谢性骨病，雌激素水平的明显下降是导致PMO的主要原因，因此PMO的防治多用雌激素替代疗法，但长期应用不良反应大，疗效不肯定［1，2］。中药治疗骨质疏松在我国具有悠久的历史，选用不良反应小，疗效高的药物治疗骨质疏松是医学的重要研究课题之一。传统中医理论认为“肾藏精，精生髓，髓养骨”、“精足则髓足”髓在骨内，髓足则骨强，故若肾精亏损，则髓无以养，而致骨质疏松，所以骨质疏松症其本在骨，属骨痿，是由于肾虚所致，肾主骨生髓，肾虚则骨空，日久发为骨痿，故补益肝肾为治疗骨痿的重要原则。传统中药杜仲是名贵滋补药材，具有“补益肝肾，坚筋骨，轻身耐老”的功效。

    骨密度是评价骨强度判断的指标,是确定骨质疏松症最基本的依据。本实验结果显示,将Wistar 雌性大鼠去卵巢后使其体内雌激素水平明显下降，到术后12 w模型对照组大鼠股骨线密度、面密度均显著低于正常对照组，成功复制骨质疏松模型，而杜仲叶醇提物组和西药尼尔雌醇组的大鼠的股骨线密度、面密度比模型对照组显著升高,说明杜仲叶醇提物和尼尔雌醇均可增加大鼠骨密度，与马中书等报道的结果一致［3］。

    雌激素是主要由卵巢分泌的一种激素,可以通过调控骨质再形成的细胞因子网络及一些体液因子对骨髓微环境及破骨细胞和成骨细胞发挥精细的调节作用来维持骨量的平衡。Bain［4］及Chow 等［5］认为对去卵巢小鼠使用高剂量雌激素,雌激素不但抑制骨吸收,而且刺激骨形成。从表2 可以看出, 与正常对照组比较, 模型对照组血清中的雌激素有明显下降(P<0.05)，与模型对照组比较, 尼尔雌醇组, 杜仲叶醇提物组血清中的雌激素明显升高(P<0.05)，说明去除卵巢导致血清中的雌激素水平明显下降, 造模成功, 应用尼尔雌醇及杜仲叶醇提物进行干预, 可提高血清中的雌激素水平 , 进而对抗去卵巢后的骨质疏松症，也提示杜仲叶醇提物可能具有弱雌激素样作用。

    IL-6为分子量26 KD含有184个氨基酸的蛋白质,可由成骨细胞、破骨细胞、造血干细胞、基质细胞、单核细胞分泌， IL-6的功能是促进破骨细胞生成,可使颗粒- 巨噬集落刺激因子(GM - CSF)增生,与其他骨吸收因子共同作用,促进骨吸收。文献报道在骨质疏松的发病机制中雌激素减少后出现的骨吸收增强最先由IL - 6启动［6］。IL -6作为分化诱导因子,使骨髓细胞分化诱导单核、巨噬细胞、并促进巨噬细胞产生IL - 6,从而加速破骨细胞形成。本研究中发现, 杜仲叶醇提物组IL-6水平明显低于模型对照组(P<0.05)，提示杜仲叶醇提物对IL-6有抑制作用,进而抑制骨吸收。

【参考文献】
  　 ［1］Marsden J. Hormone replacement therapy and breast cancer［J］.Maturitas，2000, 341( Suppl 2) : 11-24.

　　［2］Task Force. Postmenopausal estrogen replacement and risk forvenous thromboembolism: a systematic review and meta - analysis for the U. S［J］. Preventive Services Ann Intern Med，2002, 136 (9) : 42.

　　［3］马中书，王蕊，邱明才，等. 单剂补肾中药防治去卵巢大鼠骨质疏松的骨形态计量学研究［J］. 天津医药，1999,27（3）：131-134.

　　［4］Bain SD , Bailey MC , Celino DL. High-dose estrogen inhibits bone resorption and stimulates bone formation in ovariectomized mouse［J］.J Bone Miner Res , 1993 ,8 (4) :435-442.

　　［5］Chow J , Tobias JH , Colston KW. Estrogen maintains trabecular bone volume in rats not only by suppression of bone resorption but also by stimulation of bone formation［J］.J Clin In , 1992 ,89 (1) :74.

　　［6］周丕琪,沈霖,杜靖远,等. 绝经后骨质疏松症与血清IL -6、TNF -α浓度关系的临床研究［J］.中国骨质疏松杂志, 2001, 7 (1) : 1-4.

绿原酸Chlorogenic acid327-97-9

绿原酸（氯原酸,咖啡鞣酸）对照品 绿原酸98%,30%,25% 杜仲提取物Eucommia Ulmoides  P.E. 

熊果酸Ursolic acid  77-52-1 熊果酸对照品

熊果酸（乌索酸 乌苏酸）98%,95%,90%,25%,10%  枇杷叶提取物Loquat Leaf P.E

金银花提取物HoneySuchle Flowers Extract

绿原酸（氯原酸,咖啡鞣酸）Chlorogenic acid 327-97-9绿原酸98%,6%,5%

淫羊藿提取物  Epemidium Extract 

淫羊藿甙、淫羊藿甙Icariin  489-32-7  淫羊藿甙60-98% 淫羊藿甙对照品

大花紫薇提取物Banaba P.E

科罗索酸corosolic acid4547-24-4   科罗索酸对照品 科罗索酸1-98%

苦杏仁提取物Bitter Apricot Seed P.E

苦杏仁苷 苦杏仁甙 Amygdalin29883-15-6  苦杏仁甙98%HPLC

大黄素（朱砂莲甲素）Emodin  大黄提取物 大黄素5-98%

藤茶提取物Ampelopsis grossedentataP.E

二氢杨梅素（双氢杨梅素 二氢杨梅树皮素）Dihydromyricetin 27200-12-0

杨梅素 杨梅树皮素Myricetin  杨梅树皮提取物529-44-2

丹参提取物Salvia root P.E 

丹参酮IIA   Tanshinone ⅡA568-72- 9 98%   HPLC

隐丹参酮

327-97-9;77-52-1;489-32-7;4547-24-4;29883-15-6;528-82-1;27200-12-0;529-44-2;529-44-2;528-43-8;35354-74-6

528-43-8  35354-74-6

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