随着生物技术的发展，应用植物细胞培养发酵生 产药用物质正发展成为一门新型的产业体系。在植 物细胞培养中，影响细胞生长和次生代谢物形成的因 子如植物激素、气体成分、光照和培养基成分等在水 母雪莲、三七、人参和红豆杉中多有研究(孑L祥海， 2005；唐建军等，1998)，但在药用植物杜仲中很少报 道。杜仲(Eucommia ulmoides)是重要的中药材，其 药用成分包括绿原酸、桃叶珊瑚甙、总黄酮等。其中， 绿原酸(Chlorogenic acid，以下简称Cha)是一种重要 的生物活性物质，具抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中 枢神经系统等作用，它是许多中药材的有效成分之 一 ，又是某些成药的质量指标。其应用非常广泛，主 要为医药、日用化工和食品行业。绿原酸主要存在于 杜仲叶、皮中，含量较低，提取量有限，并存在农药残 留和重金属残留等问题，因此，目前多采用组织培养 技术，在组织和细胞水平上促进绿原酸的生物合成。 本文对影响杜仲细胞悬浮培养及其次生代谢物绿原 酸形成的几种主要因子如碳源、培养基、pH、激素等 进行研究，初步得出生产绿原酸的优化条件，为通过细胞培养大规模生产次生代谢物绿原酸奠定了基础。 

 1 材料和方法

 1．1实验材料

 供试材料为采自广东乐昌县杜仲基地的种子。

 1．2愈伤组织的诱导

 杜仲愈伤组织由杜仲种子萌发的无菌苗真叶诱 导。诱导的愈伤组织接种于含有2O mL B5(附加 0．5 mg／L 2，4一D、0．5 mg／L 6-BA和20 g／L蔗糖) 固体培养基的50 mL三角瓶中。置于GXZ型智能 光照培养箱中(25±2℃)培养，光照10 h／d、黑暗 14 h／d，光照强度72／~mol·m。·s- 。愈伤组织每 15～2O d继代1次，经过半年的驯化培养得到无性 细胞系。

 1．3细胞悬浮培养体系的建立

 将生长旺盛、结构疏松、易于分散的愈伤组织转 移到液体培养基中，置于摇床中进行悬浮培养，摇床 转速为110 r／rain，培养温度25±2℃ ，全天光照，光 照强度72 mo1．m-。·s～。培养2～3周后，培养液 中即有悬浮单细胞或小细胞团出现。继代培养时， 加入等量的新鲜培养液，摇匀，稍静置，待大细胞团 沉降后分瓶，不需过滤，即可得到不含大细胞团块的 培养物。这样通过3～4次继代培养，即可得到只含 单细胞或小细胞团的培养物。

 1．4悬浮细胞生长的测定

 悬浮培养细胞经尼龙网过滤，蒸馏水洗涤3次， 抽滤去表面水分，称量鲜样质量Fw(g／L)，50℃烘 干后称量干样质量DW(g／L)。细胞增长率一(收 获细胞量一接种细胞量)／接种细胞量×100 。

 1．5悬浮细胞培养物中绿原酸含量的HPLC法测定

 参考杨小梅等(2003)的方法。样品准备：将收集 的杜仲于细胞置于i00“1L锥形瓶中，加人5O 9／6甲醇 40 mL，密封后称量，超声处理6O min，放至室温，用 5O 甲醇补充至4O mL，摇匀，过滤，取滤液用0．22 m 微孔滤膜过滤，滤液供HPI￡分析用。HPLC条件：流 动相乙腈：0．1 磷酸=15：85，流速l1 0 mL／min，柱 温25℃ ，进样体积2O L，检测波长327 rlin，色谱柱 XDB-CI8 Analytical 4．6×250 mm 5—1V~cron。

 2 结果与分析

 2．1杜仲悬浮细胞生长曲线与绿原酸含量的变化

 在相同的培养条件下，分别于第3～21天每3 d随机抽取6瓶培养物，测定培养细胞的干重和其中 绿原酸的含量，结果见图1。由图1可知，杜仲悬浮 培养细胞生长曲线基本为S型，经历了4个阶段：迟 滞期、快速生长期、生长平衡期和衰亡期。在培养前 期，绿原酸的含量随细胞增长而逐渐增加，第15天 时达到最大含量。基于本研究目的是为了获得高产 量的次生代谢物绿原酸，因此，宜选取生长到第l5 天时的细胞作为种子液。

 2．2碳源对杜仲悬浮细胞生长和绿原酸含量的影响

 2．2．1不同碳源对杜仲悬浮细胞生长和绿原酸含量 的影响

 糖类是影响植物组织培养成功与否的关键 之一，糖的种类和用量不仅影响培养物生长速度和 生长量，而且影响其代谢水平和次生代谢物的合成 (韩建萍等，2003)。本实验比较了蔗糖、葡萄糖、麦 芽糖等不同碳源对杜仲悬浮细胞生长和绿原酸含量 的影响，其中不同碳源的浓度为20 g／L。由图2可 知，无论是细胞生长还是绿原酸的积累，蔗糖作为碳 源最为合适。

 3 讨论

 影响悬浮细胞培养物中次生代谢物含量的因素 很多，如外植体种性、生育状态、培养方法、培养条件 等内外因素。内在因素主要指物种的特性，外界因素 主要是培养条件如培养基类型、碳源、pH、激素等，这 些均能显著影响细胞培养过程中次生代谢物的累积。 本实验结果表明杜仲细胞生长量最大的培养基配方 其绿原酸的积累量不一定最大，N6培养基更利于细 胞生长，而MS培养基更有利于绿原酸的合成。由此 可见，适合细胞生长的培养基不一定利于次生代谢物 的累积，这与吴晓玲等(2005)、曹孟德等(2002)对黄 芩、香荚兰细胞培养的研究结果一致。就杜仲细胞培 养而言，应采用两步培养法，前期细胞增殖用N6培 养基，绿原酸积累应采用MS培养基。

 培养基的pH值作为细胞悬浮培养的重要因素 对细胞生长及次生代谢物的合成起重要作用，这是 因为培养基的酸碱度对培养基中各种营养成分(如 Fe盐中的铁离子等)的活性有直接影响，进而影响 细胞对其的吸收利用。实验表明，pH值对绿原酸的合成影响较大，当pH值为5．3时，绿原酸的含量 最大。

 细胞悬浮培养过程中，细胞生长曲线大多为S 形(阮茜等，1999)，各时期乃至整个生长周期的长短受 到植物种类、起始细胞密度、营养成分种类与配比等多种因素影响。吴晓玲等(2005)报道黄芩的细胞培养周 期为9 d，而红豆杉细胞培养周期从12～18 d不等 (Fett-Neto等，1994；Wickremesinhe& Arteca，1994； Gibson等，1993)。本实验结果表明，杜仲悬浮培养细 胞生长曲线基本为S型，经历了4个阶段：迟滞期、快 速生长期、生长平衡期和衰亡期。在培养前期，绿原 酸含量基本随细胞增长而逐渐增加，第15天时达最 大含量，即培养周期为15 d。与同是乔木的药用植物 红豆杉结果相近，适合大规模培养生产次生代谓 物绿原酸。

 外源激素常作为诱导和调节细胞生长的重要因 素而用于次生代谢产物的研究，其中生长素和细胞分 裂素的作用大不相同。一定浓度的外源激素可明显 促进细胞生长，同时会抑制次生代谢物的产生，如 NAA促进桔叶鸡眼藤悬浮培养物中蒽醌的产生，而 2，4一D则完全抑制蒽醌的合成(杨世海等，2005)。本 实验比较了三种不同浓度的外源激素2，4一D、NAA 和6一BA对杜仲悬浮细胞生产绿原酸的影响，结果显 示1．0 mg／L的6-BA促使绿原酸合成的效果最好。