【摘要】 为优化金银花中绿原酸的超声提取工艺,在单因素实验基础上,选择超声提取时间、提取溶剂量、乙醇体积分数为自变量,绿原酸得率作为响应值,采用中心组合设计的方法,研究各自变量及其交互作用对绿原酸提取的影响。采用响应面分析软件,模拟得到二次多项式回归方程的预测模型,并确定超声提取最佳工艺条件为提取时间25.55 min/次,提取溶液量为10.87倍,乙醇体积分数为71.46%,绿原酸的平均得率为2.03%。

【关键词】 金银花；绿原酸； 响应面分析； 超声提取

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或初开的花，在我国分布较广，药用历史悠久，为常用的清热解毒药。它也是国家卫生部首批颁布的既是食品又是药品的60种中药之一¨J。金银花中富含多种对人体健康有益的营养物质，如挥发油、黄酮及绿原酸类、 萜类和微量元素等。其中绿原酸是金银花中主要活性成分之一， 是植物在有氧呼吸过程中产生的一种苯丙素类化合物，抗氧化能力强，还具有抗艾滋病毒、抗肿瘤细胞、抗致畸、抗过敏及抗氧化、清除自由基等功能。

响应曲面法是Box等人提出的一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法 J，已被广泛用于生物过程的优化，但在绿原酸提取工艺研究方面的报道较少。本研究以绿原酸的提取率为响应因子，在单因素实验的基础上对超声提取过程中的各主要因素采用响应面法进行了优化，确定出金银花中绿原酸提取的最佳工艺参数，为产业化提供理论保障。

l 实验部分

1．1 试剂与仪器

绿原酸对照品(批号1 l07l5-2o0912，供含量测定用)购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯；水为市售娃哈哈纯净水，经0．45 tgn微孔滤膜过滤；冰醋酸、95％乙醇为分析纯；金银花购自百姓缘大药房，生产批号为201001 14，产地山东。 Sartorius BS22S型电子天平；KQ5200B型超声波清洗仪；UV一1800型紫外可见分光光度计；isi— lent1200系列液相色谱仪。

1．2 实验方法

1．2．1 绿原酸的提取 准确称取金银花粗粉 3．O0 g，加入一定量的提取溶液浸泡12 h，在超声波条件下提取绿原酸，提取温度为5O℃，提取2次，然后抽滤，收集滤液，将滤液用提取溶剂定容至一定体积待测。

1．2．2 绿原酸的含量测定采用紫外分光光度法对绿原酸进行定性分析，在200～400 nm波长对绿原酸对照品进行扫描，得出其最大紫外吸收波长 327 nm，并以此为检测波长，采用高效液相色谱法进行定量分析。

1．2．2．1 色谱条件Hypersil BDS C18柱(5 m， 4．0 mm×250 mm，大连依立特，柱号E1618859，批号11001)；流速1．0 mL／min；甲醇-0．6％ 冰醋酸水溶液(15：85)为流动相；检测波长327 Flm；柱温 25．0℃ 。理论塔板数按绿原酸峰计不低于1 000。

1．2．2．2 对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品3．7 mg至l0 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

1．2．2．3 样品溶液的制备精密量取提取样品 2．0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。

1．2．2．4 标准曲线的制备精密吸取对照品溶液

1，2，4，6，8，l0 ，分别注入液相色谱仪中，测定其峰面积。以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制工作曲线，计算得回归方程。

1．2．3 单因素实验分别以不同的超声提取时间、提取溶剂量、乙醇体积分数、提取功率等为因素，考察各因素对绿原酸提取工艺的影响。

1．2．4 响应面法优化实验在单因素实验的基础上，以超声提取时间、提取溶剂量、乙醇体积分数等因素作为考察对象，以绿原酸得率为响应值，采用 Design Expert 7．0．0统计分析软件的响应面法安排实验，以获取最优化工艺参数。

2 结果与讨论

2．1 绿原酸的标准曲线 绿原酸的标准曲线方程为：Y=2 362C+32．151(r=0．999 7，lq=6)，标准曲线见图1。绿原酸进样量在0．37～3．7 g范围内线性关系较好。

2．2 单因素实验结果

2．2．1 乙醇体积分数对提取效果的影响由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，绿原酸 的提取得率先增加后降低，乙醇体积分数在70％时，绿原酸得率达到最大值。这是因为乙醇体积分数过低时绿原酸不能很好地溶出，而体积分数过高又会将杂质等一起溶出。

2．2．2 提取溶剂量对提取效果的影响

由图3可知，随着提取溶剂量的增加，绿原酸的提取得率增加，但是溶剂用量在lO倍以上时，绿原酸得率变化不大。提取溶剂越大，细胞内外的浓度差越大，传质推动力也越大，内扩散的速度越大，越有利于绿原酸的溶出。当提取溶剂量达到1：10 时，已经基本达到平衡。

2．2．3 提取时间对提取效果的影响 由于超声波的空化效应、机械效应和热效应的影响，破坏植物药材的细胞，使得溶剂很快地渗透到细胞内部，而使细胞中的化学成分很快溶于溶剂中，同时加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，所以超声波提取通常比常规提取时间要短，实验结果见图4

由图4可知，随着提取时间的增加，绿原酸的提取得率先增加后降低，当超声处理25 min，绿原酸得率达到最大值。后期所出现的有所下降的趋势，主要是因为随着时间的增大，可溶性成分溶出的就越多，使得提取液粘度增大，在后期操作中有所损耗。

2．2．4 超声提取功率对提取效果的影响 当功率增大时，对植物细胞破碎作用加大，加速有效成分的溶解，绿原酸得率随超声功率的升高而增加，因此，超声提取功率选择200 W，实验结果见图5。

2．3 响应面分析法优化工艺

2．3．1 Box—Behnken设计方案根据Box—Benhnken 的中心组合实验设计原理，综合单因素影响实验结果，选取提取时间、提取溶剂量、乙醇体积分数对绿原酸提取影响显著的3个因素，在单因素实验的基础上采用3因素3水平的响应面分析方法。分析因素与水平设计见表1。

对提取时间、提取溶剂量、乙醇体积分数作如下变换X ：(t一25)／5，X =(Z一10)／2，X3=(C一 7O)／10。式中，￡、Z、C分别表示提取时间、提取溶剂量、乙醇体积分数，以绿原酸得率为响应值l，(％)，实验设计与实验结果见表2。

2．3．2 方差分析和回归方程及回归方程各项的方差分析采用Design expert程序对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表3。从表3中可以看出，方差分析结果中， ， ，霉， 和霹项影响显著，说明各个具体实验因子与响应值都不是简单的线性关系。

对表2数据进行回归拟合，确立如下回归方程预测模型： Y=2．O1+0．027X1+0．036 X2+0．031 + 0．002 5 1X2—0．007 5 XlX3—0．020 X2 一0．12 一0．038 X；一0．073 X；该模型的R =0．92，说明此模型与实际实验拟合较好，实验失拟项小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。对提取率影响的大小依次为提取溶剂量、乙醇体积分数和提取时间。

2．3．3 响应面图分析 图6～图8直观的给出了各个因素交互作用的响应面图。可以看出，提取时间、提取溶剂量、乙醇体积分数对响应值的影响均较大，表现为曲线比较陡，这与回归分析的结果吻合。 2．3．4 最优工艺条件求取为了进一步确证最佳点的值，对回归方程取一阶偏导等于0，可以得到曲面的最大点，求导方程整理得： 0．027+0．002 5 X2—0．007 5恐一0．24 Xl=0 0．036-4-0．002 5 X1—0．020 X3—0．076 X2=O 0．003 1—0．007 5 X1—0．020 X2—0．146 X3=0 求解方程组得：A=0．112 5，B=0．438 8，C= 0．146 4。最后求得超声提取时间、提取溶剂量和乙醇体积分数的最适值分别为：a=25．55 min，b= lO．87倍，c=71．46％。此时，绿原酸的理论提取率为2．02％。

经过中心组合设计优化提取条件，最佳的提取工艺参数为：超声提取时间为25．55 min，提取溶液量为10．87倍，乙醇体积分数为71．46％ ，此时绿原酸提取率的理论值可达到2．02％。验证实验表明，提取率为2．03％，与理论值相符。因此，采用响应面法得到的提取条件参数相对较为可靠，具有使用价值。

3 结论

(1)在单因素实验的基础上，应用通过中心组合实验设计和响应面分析法，优化金银花中绿原酸的超声提取条件。建立了数学回归模型Y：2．01+ 0．027X】+0．036 X2+0．031 +0．002 5 X X2— 0．007 5 X1X3—0．020 X2X3—0．12 一0．038 一 0．073 X；。本模型能较准确地预测绿原酸的提取率。

(2)通过响应面分析法优化得到绿原酸的最优提取条件为：加人一定量的提取溶液浸泡12 h，提取温度为50 ℃ ，提取2次，超声提取时间为 25．55 rain／次，提取溶液量为10．87倍，乙醇体积分数为71．46％ ，绿原酸的平均得率为2．03％。 

杜仲提取物   绿原酸  金银花提取物  苦杏仁苷  枇杷叶提取物-熊果酸    大花紫薇提取物-科罗索酸

  淫羊藿苷  二氢杨梅素  獐牙菜苦苷  杨梅素  10-羟基喜树碱  7-乙基-10羟基喜树碱

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