【摘要】：利用狗肾近端小管上皮(MDCK)细胞单层模型比较丙磺舒、牛磺酸、青霉素钠等不同药物转运蛋白底物对双黄连口服液中绿原酸分泌的影响.MDCK细胞以1.5×104个细胞/孔接种于Milli-cell-CMculture plate inserts上培养,定期观察细胞形态,测定跨膜电阻值,待细胞单层达到一定致密程度后进行分泌实验.用M2e酶标仪测定单用双黄连口服液和合用丙磺舒、牛磺酸、青霉素钠时各组双黄连口服液中绿原酸的跨细胞转运情况,计算累积分泌量.实验结果表明,合用不同转运蛋白底物后,双黄连口服液中绿原酸的分泌量均明显降低.可见绿原酸经肾小管上皮细胞的分泌过程是一可饱和过程,有机阴离子转运蛋白部分参与绿原酸的分泌机制.

【关键词】： MDCK细胞模型 绿原酸 有机阴离子转运蛋白

双黄连口服液是由金银花、黄芩和连翘提取加工制成的口服合剂，为棕红色的澄清液体，临床上用于治疗风热感冒发热、咳嗽、咽痛．绿原酸(Chlo—rogenic acid，CGA)，又名咖啡鞣酸，它被认为是许多清热解毒类中药(如金银花、忍冬藤、鱼腥草等)抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，通常被作为中药制剂的定性甚至定量指标 ．

MDCK(Madin Darby canine kidney)细胞系是由Leighton等首先建立，来源于狗肾远曲小管上皮细胞 ]，其亚型少，膜表面受体的种类和数量均大大少于Caco一2细胞 ]，这使MDCK 细胞模型的实验结果相比较而言重现性高 ]，现已被广泛用于研究物质的跨细胞转运及其机制．到目前为止，由于方法学的困难，国内外对于CGA在细胞水平上的药动学研究报道极少，对中药复方制剂中有效单体成分的药动学研究则更少．实验结果表明，合用维拉帕米可抑制小剂量组CGA 的分泌，而CGA 的外排有 P一糖蛋白(P—gP)机制参与；大剂量组CGA 的外排没有影响P-gp对CGA的外排，大剂量时CGA 的外排有可能通过其他补偿机制参与(如有机酸类的转运机制等)，抵消了维拉帕米的作用，但缺乏进一步体的外实验依据．

实验采用MDCK细胞模型，利用酶标仪测定双黄连口服液的有效成分之一— — 绿原酸的跨细胞分泌量，通过对合用不同转运蛋白底物后CGA分泌量的比较，探讨是否有其它机制参与CGA在肾小管的分泌过程，为临床用药提供参考依据．更重要的是为研究复方中药药动学研究进行方法学探索．

1 仪器与材料

层流超净工作台(SCV一4A1，Stream laboratory products)；CO2培养箱(31 1 1，Thermo electron cor— poration)；倒置显微镜(I eica，TS 100)；酶标仪 (Spectramax M2e，Molecular devices)；台式高速冷冻离心机(Biofuge primor，HERAEUS)；Millicell— ERS跨膜电阻仪，Millicell—CM culture plate inserts (Millipore公司)；24孔和96孔培养板(Corning In— corporated)．

MDCK细胞株(ATCC)；MEM 培养液，0．25 Trypsin& 0．02 EDTA混合消化液，Hanks液， PBS液，HEPES(吉诺生物医药技术有限公司)；胎牛血清(FBS)(民海生物工程有限公司)；绿原酸标准品 (南京替斯艾么中药研究所，批号：TCM026—080226)；双黄连口服液(哈药集团三精制药股份有限公司，批号：07121054)；丙磺舒(Probenecid，PBD，济南乐康信药业有限公司，批号：080422)；牛磺酸(Taurine，TAU，潜江永安药业股份有限公司，批号：TP08092199)；青霉素钠(BenzylpenicⅢin Sodium，PCG—Na，华北制药股份有限公司，批号：Y0710205)

2 方法

2．1 细胞单层模型的建立

MDCK细胞按密度1．5×1O 个细胞／TL接种到 24孔Millicell插入式培养吼(cuhure plate inserts， CPI)中，在37℃ ，5 CO 培养箱中培养，培养液为 MEM (pH7．4，含胎牛血清1O ，300 mg／I 谷氨酰胺，2 g／mI NaHCO。，100 U／mL青霉素、链霉素)， 24 h后更换培养液，以后隔天换液．用Millicell— ERS测跨膜电阻(The trans—epithelial electrical resistance，TEER)检测细胞单层的完整性．

2．2 绿原酸标准曲线的制备将2 mg绿原酸标准品溶于2 mL Hanks缓冲液(含10 mmol／I Hepes，下同)中制成母液，用 Hanks缓冲液稀释，配成质量浓度为1O0，40，10，5， 1．25 mg／L的溶液。在327 nrrl下测定吸光度，以吸光度对质量浓度做标准曲线，确定线性范围．

2．3 双黄连口服液中绿原酸的分泌实验用Hanks溶液(含10 mmol／I Hepes，下同)稀释双黄连口服液原液，使绿原酸的质量浓度分别为 20，4O，80 mg／I ．取符合转运条件细胞单层，用pH 7．4的Hanks溶液清洗两遍，第三遍加Hanks后放人培养箱孵育30 min．测TEER后加药．CPI的B 侧(基底侧，Basa1)一A侧(游离侧，Apica1)实验：按下列分组存B侧加入0．8 mI 不同药物进行实验．

(1)对照组：只加各浓度的双黄连口服液；(2)丙磺舒(Probenecid，PBD)组：2×l0 mol／I PBD+各浓度的双黄连口服液 ；(3)牛磺酸(Taurine， TAU)组：1×10 mol／I TAU+各浓度的双黄连口服液l8 ；(4)青霉素钠(Benzylpenicillin Sodium， PCG—Na)组：0．2 mol／I PCG～Na+各浓度的双黄连口服液[8]．各组A侧加入0．2 mI Hanks液，37℃ ， 5 CO 恒温培养箱下孵育，每隔30 min吸取A侧的转运液0．1 mI ，进行吸光度测量，并补充同体积空白底液．每组 一3，以Hanks溶液做空白．为了防止实验时间过长导致细胞损伤影响结果，实验时间维持2 h，实验结束时再测TEER，以确定细胞单层有没有被损伤而影响实验结果．根据标准曲线计算跨过细胞单层的绿原酸质量浓度，求累积分泌量．

2．4 统计分析

测定值以z±S表示，采用GraphPad 5．0软件浙包分析，数据用one—way AN0VA 进行分析处理检验是否有差异，检验水准：a一0．05．

3 结果

3．1 细胞形态学检查

在光学倒置显微镜下观察，MDCK细胞生长良好，至第3 d时开始融合，第5 d后细胞相互交错，第 7 d已融合成完整的细胞单层． 3．2 细胞单层的TEER测定 TEER测定公式为 TEER= (TEER~ 一TEER空膜)·A 式中，A 为细胞单层的膜面积，实验所用的Mi11i— cell-CM CPI膜面积为0．33 cm ．将MDCK细胞按细胞单层模型的建立方法培养于Millicell CPI中，每日用电阻仪ERS测量TEER．与24孔Transwell 上培养7 d后，测定TEER均大于140 Q·C1TI ，这与文献结果一致0]，表明细胞单层的致密性与完整性足够良好，可用于药物的跨膜转运实验．

3．3 绿原酸标准品的标准曲线在327 nm吸收波长下测不同质量浓度CGA 的吸光值，以吸光值对质量浓度做标准曲线，结果见图2所示．CGA 的标准曲线为一0．013 2z—O．009 1 (R 一0．999 6)

3．4 双黄连口服液中绿原酸的跨细胞分泌实验前进行电阻值测定，确定细胞单层生长的完整性．选取符合实验要求者进行分泌实验，将测得的吸光度值代入标准曲线Y一0．013 2x一0．009 1 得透过的质量浓度，计算累积透过量( g)．

绿原酸自细胞的基底侧跨过细胞进入A侧是一外排分泌过程．绿原酸的累积分泌量随时间逐渐增加，是一种时间依赖性过程(图3)．低浓度组在9O ～ 120 min之间出现分泌的累积平台，分泌量约为 (O．156±0．020)／xg．根据CGA分泌的时间依赖性特点，接下来的联合给药实验都采用90 min的分泌时间，以保证分泌稳态时间点的一致性．随着B侧双黄连口服液中绿原酸浓度的成倍增加，其累积分泌量差异却很小(P>0．05)，说明分泌过程不是浓度依赖性的被动扩散转运过程，而是转运蛋白(或称为载体)依赖的可饱和的转运过程．

3．5 不同转运蛋白底物对双黄连口服液中绿原酸 跨细胞分泌的影响

结果见图4．PBD明显抑制CGA的分泌，尤其是小剂量CGA组，减少了54．4 (P<0．001)．中剂量组和高剂量组，PBD 的作用相对较弱，合用 PBD后CGA 的分泌量分别减少了36．9 (P< 0．01)，38．8 (P

4 实验讨论

药物经肾排泄包括肾小球滤过、肾小管重吸收和肾小管分泌．药物经肾小管上皮细胞直接排入肾小管腔内的过程称为肾小管分泌，一般认为该过程是一主动过程．实验证明，双黄连口服液中的绿原酸存在自基底侧向游离侧出胞的分泌过程．绿原酸为一有机酸，理论上有可能经P一糖蛋白(P—glycopro— tein，P—gP)机制外排，也可能经有机阴离子转运蛋白分泌外排l8]．已有实验结果表明，P—gP抑制剂维拉帕米_g 能显著地抑制中、小剂量的双黄连口服液中绿原酸的外排(对低剂量组尤为明显)，对于高剂量影响甚小，推测P—gp参与绿原酸的外排但活性不高，绿原酸可能通过有机酸(如青霉素)类的转运机制外排．该实验的目的在于论证这一假设．MDCK 细胞为狗。肾近端小管上皮细胞，MDCK细胞单层模型是研究药物跨肾小管上皮细胞转运的理想模型．

有机阴离子转运蛋白(Organic anion transporter， OAT)和转运肽家族(Organic anion-transporting poly— peptide family，OATP)，是体内排泄有机阴离子类物质的重要载体 ]．已知OAT又分为OAT1一OAT5采用竞争抑制剂是研究物质转运的重要方法．常用的研究有机阴离子类转运的工具药有丙磺舒、青霉素、牛磺酸等．丙磺舒为OAT和OATP的底物，能竞争性地抑制有机阴离子的跨细胞转运[1 ．牛磺酸是一种含硫氨基酸，又称氨基乙磺酸L】 ．青霉素选择性抑制存在于近曲小管上皮细胞的基膜侧的 OAT3而对oAT1作用差L8j．

实验结果显示，通过合用不同转运蛋白底物后，双黄连口服液中绿原酸的分泌量均有降低，说明它们对绿原酸的外排分泌有一定的竞争性抑制作用，其中以青霉素钠作用最强，提示OAT3介导绿原酸 的分泌．文献报道，同时静脉给予双黄连与抗生素时，绿原酸与抗生素的排泄会减少『1引，与文中结果吻合．除0AT和OATP转运蛋白外，肾小管上皮细胞腔侧面还存在多药耐药蛋白P—gp，属于ATP依赖型(ATP-binding cassettes，ABC)转运蛋白超家族[1 ，其作用为促进药物或内源性底物从肾小管上皮细胞向尿液的排泄．笔者发现P—gP亦参与介导绿原酸的分泌．因此，绿原酸的肾排泄(分泌)过程可能有P-gp，OAT或OATP等多种药物转运蛋白参与．

5 结论

实验以双黄连口服液中的绿原酸为研究对象，对复方中药中有效成分的跨细胞分泌机制做了探讨，发现除了P—gP部分参与绿原酸的外排，还有其他转运蛋白也参与绿原酸的肾排泄过程，如OAT 或oATP，可见绿原酸的肾小管分泌过程有多种蛋白介导参与．研究结果对了解以CGA 为主要有效成分的中药制剂药动学(经肾排泄)有一定参考意义．另外，运用细胞模型研究复方中药有效成分的药动学，有可能带来中药药动学研究的革命性进步．

杜仲提取物   绿原酸  金银花提取物  苦杏仁苷  枇杷叶提取物-熊果酸    大花紫薇提取物-科罗索酸

  淫羊藿苷  二氢杨梅素  獐牙菜苦苷  杨梅素  10-羟基喜树碱  7-乙基-10羟基喜树碱

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