【关键词】超临界流体萃取 CO2萃取技术 酸提取高效液相色谱法 纯度 成分提取 溶解能力 临界温度

【摘  要】超临界流体萃取（SFE）技术是利用流体在临界点附近所具有的特殊溶解能力而进行有效成分提取的新技术。CO2的超临界温度接近室温，超临界压力低，无色、无味、无毒、不燃烧爆炸、对大部分物质不反应，价格低廉、易制得，是极好的超临界流体萃取溶剂。天然植物中熊果酸的测定方法主要有两种，即薄层分析和高效液相色谱法，而提取方法却有多种，,其中制约熊果酸批量生产的难题是分离提纯.

     超临界流体萃取（SFE）技术是利用流体在临界点附近所具有的特殊溶解能力而进行有效成分提取的新技术。CO2的超临界温度接近室温，超临界压力低，无色、无味、无毒、不燃烧爆炸、对大部分物质不反应，价格低廉、易制得，是极好的超临界流体萃取溶剂。天然植物中熊果酸的测定方法主要有两种，即薄层分析和高效液相色谱法，而提取方法却有多种，其中制约熊果酸批量生产的难题是分离提纯。近年来，我们采用 超临界CO。萃取技术结合生物发酵法从越桔叶渣中提取熊果酸，效果满意。现报告如下。

     材料设备：① 材料：提取原料为我公司从越桔叶中提取熊果苷后的废渣。其粒径大小依生产要求而定；熊果酸标准品 由中国药品生物制品检定所提供；其余试剂均为分析纯；聚酰胺柱层析材料为实验室用；酵母菌种由襄樊市中心(三甲)医院提供，经襄樊市药检所确定；CO 、乙醇由襄樊市采购，纯度 分别>99％和99．5％。② 仪器设备：高压液相色谱仪(大连依 利特公司)，由P200Ⅱ高压恒流泵、UV200Ⅱ紫外可变波长检测 器及Echrom 98色谱工作台等部件组成；全套实验用设备由杭州华黎泵业有限公司提供，主要包括l L的萃取釜(工作条件：室温～8O C，压力2O～50 mPa)，0．5 L分离器(工作条件：室温～ 8O C，压力20~30 mPa)，换热器。降压阀，加压泵等。

     试验方法及结果；① 样品的生物发酵：干燥的越桔叶粉碎至4o～80目，以水作溶媒提取水溶性成分，滤干水分后趁 湿进入发酵房(池)，用37 C摇瓶培养过夜的酿酒酵母菌液按 1％的比例进行接种，采用38℃ 的发酵温度发酵48 h(是在以 3O、38、45的发酵温度分别发酵24、48、72 h的试验基础上确 定的最佳发酵温度和时间)，立即以90‘C的高温烘干12 h备 用。②样品的萃取条件：由于影响萃取物的技术参数较多，我们主要选取了萃取温度(40、50、60、70 C)、压力(25、30、35、 38 mPa)、时间(1、2、3、4 h)三因素，各因素选择了四个水平．以熊果酸的萃取率为考察指标，按I 。(3‘)正交表进行正交实 验，探讨其最佳反应条件。结果影响熊果酸提取率的主要因素 依次为：萃取压力>萃取温度>萃取时问。通过方差分析确定 的最佳工艺条件为B A C。，即以萃取压力35 mPa、萃取温度 50‘C、萃取时问3 h为最佳 经过对粒径、夹带剂、溶剂CO：的流速、操作连续性等技术指标的多次实际操作，结果发现采用 4O～80目粒径的原料以流速0．5 ml／min的95％ 乙醇为夹带 剂、以CO 流速0．5 ml／min提取3 h，即可达到最好的萃取效 果。⑧ 样品测定：采收样品1 ml与熊果酸对照品(配成含熊 果酸1 ug／ml的甲醇溶液)1 ml点于同一硅胶G薄板上，以 环己烷一氯仿一醋酸乙酯(15：5；8)为展开剂展开，取出晾干，喷以1O％硫酸乙醇溶液，105℃烘烤10 min，显现相同的 紫红色斑点。色谱条件：Hydersir BDSC18色谱柱(5 m，200× 4．6 mm)，流动相甲醇：水(90：10)。磷酸盐调pH值3．5，流速0．5 ml／min，检测波长210 nm，进样量5 l，柱温室温。采 收样品0．5 ml，用甲醇溶于250 ml容量瓶中，过0．45 m滤膜，与熊果酸对照品(配成含熊果酸2．0~g／ml的甲醇溶液) 以上述条件进行分析，以峰面积外标法定量，结果重复操作3 次，熊果酸的平均含量为95．7％。

     讨论；熊果酸又名乌索酸、乌苏酸，为五环三萜类化合物， 熔点264～267 C，其分子中含有一COOH、一OH两极性基团，在超临界CO 中的溶解度变小。该实验中以较高的萃取温度 (5O℃)、压力(35 mPa)即可提高超临界CO 萃取熊果酸的效 率。超临界CO 萃取的熊果酸虽然效率高，但成品含量并不能 达到要求的纯度。而采用聚酰胺柱层析，收集75％乙醇洗脱 的部分液体后精制，即可得到纯度>95 的熊果酸。采用发酵 法对越桔叶渣进行生物发酵，可使结合的熊果酸衍生物水解 后成为游离的熊果酸，产品收率比单独超临界萃取提高8％． 纯度>95 ；发酵后立即高温烘干可杀灭酵母菌种，避免微生物的污染。

     综上所述，用超临界CO 萃取柱分离技术从发酵的越桔 叶渣中提取高纯度熊果酸的工艺流程中，超临界是通过控制温度和压力实现的，COz作为提取溶剂无毒、无味、不燃、不腐 且可循环使用；乙醇提取物及用含量一定的乙醇作夹带剂、洗脱剂，甲醇作流动相，用量小且易于回收，对环境不构成污染： 利用废弃的越桔叶渣，经生物发酵、高温灭菌后提取熊果酸，可达到废物利用，且废料中不含可传染病菌及有毒的溶剂成 分；再次提取脂溶性成分后的越桔叶渣为粗纤维，可作农家肥原料，有利于土壤疏松。

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