【关键词】Caco-2细胞模型 MDCK细胞模型 绿原酸 P糖-蛋白 药动学 跨细胞转运

【文　摘】目的利用Caco-2和MDCK细胞单层模型研究绿原酸（chlorogenic acid,CGA）的跨细胞转运过程及其机制。方法①Caco-2和MDCK细胞单层模型建立：Caco-2、MDCK细胞分别按密度1×10^5、5×10^4个细胞/cm2接种到Milli-cell-CM culture plate inserts上培养,待细胞单层达到一定致密程度后进行透过实验。②透过实验：用M2e酶标仪测定CGA在不同方向、不同浓度下的跨细胞转运情况并计算累积透过量。结果在两种细胞模型上CGA均有不同程度的双向跨细胞转运（吸收和分泌）,P-gp抑制剂维拉帕米能明显减少CGA的分泌。结论CGA跨细胞转运同时存在吸收和分泌的动力学过程。P-gp部分参与CGA的分泌机制。

绿原酸(chlorogenic acid，CGA)又名咖啡鞣酸，是一种抗氧化性很强的多元酚化合物，它被认为是许多清热解毒类中药(如金银花、忍冬藤、鱼腥草等)的主要有效成分，药理作用广。通常被作为中药制剂质量指标之一。

静脉注射绿原酸后体内代谢消除极快，消除半衰期只有十几分钟 J，但口服吸收差，在小肠几乎以原型吸收(水解成咖啡酸的量约1％)，解决CGA应用的一个关键是提高生物利用度，而跨细胞转运能力是口服药物吸收的决定性的环节。目前广泛应用的离体药物吸收模型主要是Caco一2和MOCK细胞单层模型(以下简称Caco一2一M和MOCK-M)。Caco- 2细胞系来源于人结肠癌，形态与人小肠上皮细胞十分相似，因此能够很好地预测药物的口服吸收能力。Caco-2．M通常用于体外药物分子肠吸收的研究 J。但Caco一2．M 的建立周期长(需21 d)，而 MOCK细胞具有生长快的优势，形成完整单层仅1 wk左右。MDCK来源于狗肾上皮细胞，细胞亚型少，细胞膜表面受体的种类和数量均大大少于Caco一 2细胞_4j，这种简单性使MDCK—M的实验结果重现性高。有研究发现MDCK M在研究以被动扩散方式经肠吸收的药物时，预测吸收能力上相对于Caco- 2一M略占优势 J。目前没有两种细胞对于CGA吸收有何差异的研究报道。本文应用MOCK—M研究 CGA跨细胞转运情况，并考察维拉帕米(Verapamil， Ver)对其影响，在细胞、分子水平阐明绿原酸的吸收和分泌过程，并且与Caco．2一M的结果进行比较。

1 材料

1．1 药品与试剂Caco-2细胞株和MDCK细胞株 (ATCC)，MEM 培养液，Trypsin&EDTA混合消化液，Hanks液，PBS液(吉诺生物医药技术有限公司)，胎牛血清(FBS，民海生物工程有限公司)， Hepes(Lvshengyuan Biotechnology)，绿原酸(南京替斯艾么中药研究所，TCM026-080226)，盐酸维拉帕米注射液(上海禾丰制药有限公司，071201)，荧光素钠(上海迈坤化工有限公司，20070520)。

1．2 主要实验仪器层流超净工作台(Stream La— boratory products)，CO2培养箱(Thermo Electron Cor— poration)，倒置显微镜(Nikon Eclipse，TS 100)，酶标仪(Spectramax M2e，Molecular Devices)，台式高速冷冻离心机(Biofuge primo R，Heraeus)，Millicell— ERS、Millicell—CM culture plate inserts(CPI，Millpore 公司)，细胞孔培养板(Coming公司)。

2 方法

2．1 细胞单层模型的建立Caco一2和MDCK细胞分别按密度1×10 ，5 X 10 个细胞／cm 孔接种到 24孔CPI中，在37~C，含体积分数为0．05的CO，孵箱中培养，培养液为MEM(pH 7．4，含体积分数为 0．1的FBS、300 mg·L 谷氨酰胺、2 g·ml～NaH— CO3、1×10 U·L 青霉素、1×10 mg·L一链霉素)，24 h后更换培养液，以后隔天换液。用Milli． cell—ERS测跨细胞单层膜电阻(The epithelial electrical resistance，TEER)，荧光素钠透过率检测细胞单层的完整性。实验方法参考文献l6 J，荧光素钠的起始浓度为2 g·L～。

2．2 CGA在Caco-2-n 和MDCK-M 上的吸收和分泌

2．2．1 绿原酸标准曲线的制备将2 mg CGA溶于2 ml的Hanks缓冲液(含0．01 tool·L～Hepes，下同) 中，配成浓度为100、40、10、5、1．25 mg·L。。的溶液，在327 nm下测定OD值，以OD值对浓度做标准曲线，确定线性范围。

2．2．2 绿原酸的吸收研究 用Hanks溶液稀释 CGA，使溶液质量浓度分别为20、40、80 mg·L～。取符合转运条件细胞单层，pH 7．4的Hanks溶液清洗两遍，培养30 min，测TEER后加药。CPI的A侧 (细胞游离侧，Apica1)一B侧(基底侧，Basolatera1) 实验：A侧分别加入0．2 ml不同浓度的药物溶液，B 侧加入0．8 ml Hanks溶液，37℃孵箱中培养，每隔 30 min从B侧取样0．1 ml测OD值，并补充同体积空白底液，以Hanks溶液为对照。为了防止实验时间过长导致细胞损伤影响结果，透过实验时间维持 3 h，试验结束时再测TEER，以确定细胞单层没有被损伤而影响实验结果。根据标准曲线计算跨过细胞单层的CGA浓度，求累积透过量。

2．2．3 绿原酸的分泌研究方法基本同2．2．2，不同的是在CPI的B侧加入待测药物，A侧加入Hanks 溶液，37℃孵箱中培养，隔30 min吸取A侧的转运液0．1 ml，测OD值。

2．2．4 维拉帕米对CGA跨膜分泌的影响 方法基本同2．2．3，其中一组含有10一mol·L 的Ver。 2．3 统计学分析测定值以 ±S表示，采用 GraphPad 5．0软件包分析，组间比较采用t检验。

3 结果

3．1 细胞形态学检查与TEER测定 在倒置显微镜下观察，Caco．2细胞生长至d 5～6时达到融合，生长到10 d后逐渐均匀、致密，边界清晰，可清楚地看见细胞之间的界限，到21 d形成致密的细胞单层；MDCK细胞生长至3 d开始融合，7 d融合成完整的细胞单层。细胞单层的完整性以TEER来确定。 TEER=(TEER测定一TEER空膜)×A；Caco-2 细胞接种于CPI培养至21 d，测TEER均大于600 Q·am ；MDCK细胞培养7 d，测定TEER均大于 140 n ·cm ，两者与文献结果一致， ，表明细胞单层的致密性与完整性足够良好，可用于药物的跨膜转运实验。

3．2 荧光素钠透过率检查 在CPI上荧光素钠透过速度很快，前30 min已有20．53％的荧光素钠透过空白膜，而生长有Caco．2细胞和MDCK细胞的膜透过量都只有0．02％，可认为基本不透过；2 h内 Caco一2一M总透过仅为0．62％ ，MDCK—M的总透过仅 0．90％，而空膜已透过20．78％，与文献结果一致』，表明两模型的致密性与完整性足够好，均可用于药物的跨膜转运实验。

3．3 绿原酸在Caco-2-M 和MDCK-M 模型上的吸收CGA标准曲线：在1．25 mg·L 至100 mg· L 内，，，=0．013 2X一0．009 1；r =0．9 996。 Fig 1结果表明，在Caco一2-M上CGA累积透过量随时间延长逐渐增加，且与加入的CGA量呈正变关系。

Fig 2表明，绿原酸在MDCK．M上吸收更快，达峰更早(120～150 min左右达峰值)，剂量增加但峰值增加甚微，40、80 mg·L 两组曲线接近重合，提示 CGA在MDCK—M上的吸收有饱和特性；其后累积吸收量反而减少。推测CGA可能以主动转运方式(分泌)返回A侧，因为此时A侧的CGA浓度仍大大高于B侧。

3．4 绿原酸在Caco-2-M 上的分泌CGA自细胞的 B侧跨过细胞层进入Am4是一外排(分泌)过程。 Fig 3A表明CGA在Caco-2一M上的累积分泌量随时间延长和初始CGA加入量的增多而逐渐增加，40 mg·L-l与80 mg·L 组前60 min分泌量差别明显，其后二曲线趋于重合，提示有饱和现象，符合主动转运特征，这是与吸收过程明显不同之处。在B侧加入10～tool·L 的Ver，CGA分泌进入A侧的影响见Fig 3B，在P—gp抑制剂Ver的作用下各剂量组CGA的累积分泌量均有所减少。 3．5 CGA在MDCK-M 上的分泌Fig 4A表明80 mg·L 组在120 rain、40 mg·L 组在150 min时分泌量达峰值且维持平衡，二者的量几乎相等，亦提示饱和特征。

在B侧加入10～mol·L 的Ver，对CGA分泌进入A侧的影响见Fig 4B，Ver能减少CGA的外排，对低、中剂量组抑制作用较大，但对高剂量组抑制作用较小。

3．6 P-糖蛋白(P-gp)抑制剂Ver对绿原酸分泌过程的抑制作用在B侧加入10～tool·L 的Ver 进行透过实验，以A侧药一时间曲线下面积( g· h)为指标分析Ver对CGA分泌的影响，结果见Fig 5。

P—gP可将药物从细胞内主动排至细胞外，而药物外流是造成多种药物口服无效的重要原因。Fig3，4，5表明，P．gP抑制剂Ver明显抑制小剂量组 CGA的外排但对高剂量组影响较小。该结果的可能解释是：绿原酸的外排有P。gP机制参与；P—gP对 CGA的外排活性有限，因而对小剂量组效果好；大剂量组CGA的外排有可能通过其他补偿机制(如有机酸类的转运机制等)参与，抵消了Ver的作用。

4 讨论

通过对CGA在Caco一2一M和MDCK—M上跨细胞转运特点的比较研究，对绿原酸在肠粘膜和肾小管的吸收／重吸收、分泌过程有了较清晰的认识。由于Caco-2细胞是结肠细胞，细胞连接比小肠更为紧密，对靠简单扩散机制吸收的药物分子，ca． co-2一M一般都低估其吸收能力。在预测靠简单扩散机制跨膜的带电小分子吸收能力上，MDCK—M可能比Caco-2．M更为合适 J。绿原酸是一种水溶性小分子，我们有资料(待发表)证明，有一定量CGA经被动的脂溶扩散转运。本文发现，CGA在MDCK—M上吸收更快更多，支持这一观点。

CGA在MDCK—M上的吸收有饱和特征，提示有转运蛋白(transporter)参与。按照权威教科书 I 观点，脂溶性小分子物质在肾小管以被动(脂溶)扩散方式重吸收。本实验结果与一般观点相违，丰富了对肾小管重吸收过程的科学认识。

CGA在两种细胞模型上的累积分泌量随时间延长和初始绿原酸加入量增多而逐渐增加，但这种增加是非线性的，有饱和现象，符合主动转运特征，与教科书的分泌为主动转运过程的一般观点一致。肾小管是药物重吸收与分泌主要场所。就细胞来源而言，用MDCK—M来了解药物肾排泄机制最合适，故本文研究结果对了解以绿原酸为主要有效成分的中药制剂药动学(经肾排泄)有一定参考意义。 CGA为一有机酸，理论上有可能经P一印机制外排，也可能经有机阴离子转运蛋白(organic anion transporter，OAT)分泌外排 l1]。本实验结果表明， P—gP抑制剂Ver能明显抑制CGA的分泌，表明CGA 的分泌机制有P—gP参与。但Ver的抑制作用与P— gp的底物(CGA)浓度呈负相关：即对低浓度组作用强，但对高剂量组影响小，推测CGA的分泌有多种分子机制参与，P—Pg参与绿原酸的外排但活性不高，存在室顶现象(ceiling effect)，故P—Pg对低浓度 CGA的外排作用明显，而高浓度时CGA可能通过其他的转运机制外排，抵消了Ver的作用，故CGA 浓度高时Ver作用差。我们已有资料(待发表)初步证明OAT部分参与绿原酸的分泌。

总之，在两种细胞模型上，CGA均同时存在吸收／重吸收、分泌过程，P—gP部分参与了CGA的分泌；CGA在肾小管细胞的重吸收有转运蛋白参与。上述机制的综合结果决定血药浓度的高低，最终影响药效。对药物跨细胞转运机制的了解，可在比传统药动学研究更深入的层次上认识药动学过程进而指导联合用药，改善药动学过程，如我们发现双黄连口服液中的CGA吸收比绿原酸标准品的吸收更好 (待发表)，这可能是复方中存在P。gP抑制剂的结果。细胞模型和经典药动学方法的结合，应是今后药动学特别是中药复方的药动学研究的重要发展方向之一。