杨梅树皮素诱导人肝癌ＨｅｐＧ２细胞凋亡机制的研究 | 杨梅树皮素诱导人肝癌ＨｅｐＧ２细胞凋亡机制的研究 |
| 发布时间:2011-04-28 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:3516 |
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摘要：探讨杨梅树皮素（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ，ＭＹＲ）对人肝癌ＨｅｐＧ２抑制生长和诱导凋亡作用及其机制。：ＭＴＴ法研究ＭＹＲ对人肝癌ＨｅｐＧ２的抑制生长；荧光染色和电子透射电镜观察ＨｅｐＧ２细胞形态；流式细胞仪研究ＭＹＲ对ＨｅｐＧ２细胞周期的影响及诱导凋亡作用，罗丹明１２３单染观察ＭＹＲ对线粒体膜电位的改变；ｃａｓｐａｓｅ３，９试剂盒检测ＭＹＲ对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞内ｃａｓｐａｓｅ３，９活性的影响。：ＭＹＲ对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞生长具有明显的抑制作用，并具有剂量依赖性，ＩＣ５０为５８６６１７ｍｇ·Ｌ－１；ＭＹＲ作用７２ｈ后，ＨｅｐＧ２细胞呈现典型细胞凋亡特征，细胞周期阻滞于Ｇ２／Ｍ期，凋亡率最高为６４７３％。同时线粒体膜电位明显下降，ｃａｓｐａｓｅ３，９活性增加。：ＭＹＲ对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞有明显的抑制生长和诱导凋亡作用，其机制可能与线粒体凋亡途径有关。 关键词：杨梅树皮素；ＨｅｐＧ２细胞；细胞凋亡；膜电位；ｃａｓｐａｓｅ３，９ 杨梅树皮素（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ，ＭＹＲ）是从藤茶Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓｇｒｏｓｓｅｄｎｔａｔａ茎叶中或杨梅树皮和树叶中提取的有效成分之一，为黄酮类化合物［１］。在人类白血病细胞ＨＬ６０中，杨梅素通过诱导细胞凋亡降低肿瘤细胞活性，从而抑制肿瘤的生长［２］。但其对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞增殖抑制作用及机制尚未见报道。 为此本实验选取ＨｅｐＧ２细胞为研究对象，采用ＭＴＴ比色法、流式细胞术和分光光度法，通过观察ＭＹＲ对ＨｅｐＧ２细胞凋亡、线粒体膜电位和ｃａｓｐａｓｅ３，９活性影响，初步探讨ＭＹＲ诱导ＨｅｐＧ２细胞凋亡的分子机制，为深入研究其在肿瘤方面的功效提供一定的理论基础。 １ 材料 １１ 药物与试剂 人肝癌细胞ＨｅｐＧ２（由哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站传代保种）。杨梅树皮素（徐州弘康科技有限公司，纯度为９０％）。小牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司）；噻唑蓝（ＭＴＴ，Ａｍｅｒｅｓｃｏ公司）；戊二醛（北京化工厂）；ＲＮＡ酶（Ｓｉｇｍａ公司）；ＲＰＭＩ１６４０培养液（Ｇｉｂｃｏ），Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８（０６２０１０），碘化丙啶（ＰＩ），罗丹明１２３均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；ｃａｓｐａｓｅ３，９试剂盒（北京碧云天生物科技有限公司）。 １２ 仪器 酶标仪（瑞士ＴＥＣＡＮ公司），荧光显微镜（德国Ｌｅｉｃａ公司），倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），流式细胞仪ＣＬＯＵＴＥＲＥＰＩＣＳＸＬ（美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司）。 ２ 方法 ２１ ＨｅｐＧ２细胞培养 用含１０％小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液，在５％ＣＯ２，３７℃培养，细胞呈贴壁生长，用０２５％的胰酶消化传代，用于实验的细胞均处于对数生长期。 ２２ ＭＴＴ法检测杨梅树皮素对ＨｅｐＧ２细胞的生长抑制作用［３］ 将对数生长期的细胞，调整细胞为１×１０４个／ｍＬ，按每孔１０００个接种于９６孔板，每孔１００μＬ。次日加入ＭＹＲ（终浓度分别为２０，４０，６０，８０，１００，１２０，１４０ｍｇ·Ｌ－１），溶剂对照组及阳性对照组阿霉素１０ｍｇ·Ｌ－１，每孔加１００μＬ，培养７２ｈ，弃上清，每孔加１００μＬ的０５ｇ·Ｌ－１ＭＴＴ，继续培养４ｈ，弃上清，每孔加２００μＬＤＭＳＯ溶解ＭＴＴ甲簪沉淀，用酶标仪在参考波长４５０ｎｍ，检测波长５７０ｎｍ条件下测定吸光度值Ａ，计算肿瘤细胞的抑制率。
２３ 荧光显微镜法观察细胞形态［４］ 取指数生长期的人肝癌细胞ＨｅｐＧ２，调整细胞为３×１０５个／ｍＬ，于６孔板中每孔接种１ｍＬ。２４ｈ后试验组加入ＭＹＲ（使其终浓度分别４０，６０，８０，１００ｍｇ·Ｌ－１）；阿霉素１０ｍｇ·Ｌ－１；对照组加入同体积培养液。继续培养７２ｈ后，ＰＢＳ洗１遍，加固定液（甲醇冰醋酸３∶１），４℃固定１０ｍｉｎ后，加入５ｍｇ·Ｌ－１的荧光探针Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８，置培养箱中孵育１５ｍｉｎ，取出盖玻片，置于荧光倒置显微镜上观察细胞形态。 ２４ 透射电镜法观察细胞状态［５］ 收集细胞，冷ＰＢＳ洗２次，４％戊二醛固定，１５００ｒ·ｍｉｎ－１１０ｍｉｎ，加入琼脂搅匀，冷却后切块，１％四氧化锇固定，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，透射电镜观察细胞状态。 ２５ 细胞周期分布和凋亡比例检测［６］ 取指数生长期的人肝癌细胞ＨｅｐＧ２，调整细胞为３×１０５个／ｍＬ，于６孔板中每孔接种１ｍＬ。２４ｈ后试验组加入ＭＹＲ（使其终浓度分别４０，６０，８０，１００ｍｇ·Ｌ－１）；阿霉素１０ｍｇ·Ｌ－１；对照组加入相同体积的培养液。７２ｈ后，收集作用到预定时间的ＨｅｐＧ２细胞，７０％冷乙醇４℃固定过夜。固定后的细胞用ＰＢＳ洗２遍并悬浮之，加入ＰＩ染液（终浓度为５０ｍｇ·Ｌ－１），３７℃避光温育３０ｍｉｎ，用流式细胞仪检测，计算出细胞周期分 布和凋亡情况，激发波长４８８ｎｍ，发射波长６３０ｎｍ。 ２６ 线粒体膜电位检测［７］ 取指数生长期的人肝癌细胞ＨｅｐＧ２，加入适量０２５％胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用含１０％胎牛血清的培养基制备成３×１０５个／ｍＬ的细胞悬液，于６孔板中每孔接种１ｍＬ。将平板置于３７℃，５％ＣＯ２培养箱。２４ｈ后加入ＭＹＲ（使其终浓度分别为４０，６０，８０，１００ｍｇ· Ｌ－１）；阿霉素１０ｍｇ·Ｌ－１；阴性对照组加入不含药物相同体积的培养液。７２ｈ后细胞用胰酶消化，加ＰＢＳ洗２遍，分别加入终浓度１０μｍｏｌ· Ｌ－１的罗丹明１２３置于３７℃孵育３０ｍｉｎ，孵育后离心（２０００ｒ·ｍｉｎ－１，１０ｍｉｎ），用ＰＢＳ洗２次，再用３００目尼龙网过滤后用流式细胞仪检测细胞荧光强度，激发波长４８８ｎｍ，发射波长５２５ｎｍ。 ２７ ｃａｓｐａｓｅ３，９活力的检测［８］ 取指数生长期的人肝癌细胞ＨｅｐＧ２，加入适量０２５％胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用含１０％胎牛血清的培养基制备成密度为３×１０５个／ｍＬ的细胞悬液，于６孔板中每孔接种１ｍＬ。将平板置于３７℃，５％ＣＯ２培养箱。２４ｈ后不同浓度的ＲＥＳ，使其终浓度分别４０，６０，８０，１００ｍｇ· Ｌ－１；阿霉素１０ｍｇ·Ｌ－１；阴性对照组加入不含药物相同体积的培养液。药物作用７２ｈ后利用ｃａｓｐａｓｅ３，９试剂盒检测ｃａｓｐａｓｅ３，９的活性。 ３ 结果 ３１ 杨梅树皮素对ＨｅｐＧ２细胞的生长抑制作用 结果显示ＭＹＲ对ＨｅｐＧ２细胞具有生长抑制作用并具有明显的剂量依赖性，其ＩＣ５０值为５８.６６１７ｍｇ·Ｌ－１（表１）。
３２ 杨梅树皮素对ＨｅｐＧ２细胞形态学改变的影响 ＨｅｐＧ２细胞随ＭＹＲ作用浓度的增高出现不同程度的凋亡改变，荧光显微镜下对照组细胞核形状正常，呈圆形，染色均匀，其核内染色体呈均匀分布；而ＭＹＲ作用ＨｅｐＧ２细胞７２ｈ后，其细胞核固缩、凝聚，出现浓染致密的颗粒块荧光。透射电镜进一步显示细胞部分核膜向外膨出，胞质有大小不等的空泡，微绒毛数量减少，线粒体、粗面内质网等细胞器减少（图１，２）。 ３３ 流式细胞仪检测ＨｅｐＧ２细胞凋亡和细胞周期变化 流式细胞术检测显示，不同浓度的ＭＹＲ（４０～１００ｍｇ·Ｌ－１）作用ＨｅｐＧ２细胞７２ｈ后可引起ＨｅｐＧ２肿瘤细胞凋亡。ＭＹＲ作用７２ｈ后，Ｇ１期细胞的比例减少，Ｓ期细胞的比例无明显影响，Ｇ２期细胞的比例增加，表明杨梅树皮素对ＨｅｐＧ２细胞周期的Ｇ２／Ｍ期有一定的阻滞作用，并且能诱导其凋亡并呈明显的剂量依赖性（表２）。
Ａ对照组；Ｂ杨梅树皮素４０ｍｇ·Ｌ－１；Ｃ杨梅树皮素６０ｍｇ·Ｌ－１；Ｄ杨梅树皮素８０ｍｇ·Ｌ－１； Ｅ杨梅树皮素１００ｍｇ·Ｌ－１；Ｆ阳性对照组。 图１ 荧光显微镜观察杨梅树皮素对ＨｅｐＧ２细胞形态学改变的影响 Ａ
Ａ对照组；Ｂ杨梅树皮素６０ｍｇ·Ｌ－１；Ｃ杨梅树皮素１００ｍｇ·Ｌ－１。 图２ 电子透射电镜观察杨梅树皮素对ＨｅｐＧ２细胞形态学改变的影响（×６０００
３４ 杨梅树皮素对ＨｅｐＧ２细胞线粒体膜电位的影响 细胞经罗丹明１２３染色，流式细胞仪检测，结果显示经不同浓度ＭＹＲ作用后的ＨｅｐＧ２细胞与空白对照组相比（空白组的荧光强度为７９８％）线粒体膜电位显著降低。各剂量组的荧光强度分别为５６６％，４８６％，４６６％，４２４％，阳性对照组（阿霉素１０ｍｇ·Ｌ－１）的荧光强度为５４７％（表３）。
３５ 杨梅树皮素对ＨｅｐＧ２细胞ｃａｓｐａｓｅ３，９活性的影响 经不同浓度ＭＹＲ作用后的ＨｅｐＧ２细胞中ｃａｓｐａｓｅ３，９活性增加。正常情况下ｃａｓｐａｓｅ３，９活性水平较低，Ａ４０５值分别为００２５和００２０，在ＭＹＲ作用下，其活性升高，Ａ４０５分别升至为００３１，００４６，００５５，００６３和００３２，００５６，００８３，００９８，与空白对照组相比，差异有统计学意义（Ｐ＜００５）（表４）。 ４ 讨论 近年来，寻找有效的抗肿瘤天然药物成为研究的热点之一，许多文献［９１０］报道杨梅素对多种肿瘤具有杀伤作用，在临床上用于治疗食管腺癌、结肠癌等多种癌症。体外实验研究表明ＭＹＲ对ＨｅｐＧ２细胞有明显的抑制作用，且存在剂量效应关系；通过光镜、电镜形态学观察，可见胞体缩小，胞浆凝缩，核内染色质从均匀分布逐渐凝集成新月状，附
在核周边，密度明显增高，界限清楚、胞膜完整、内质网扩张、空泡化，表面微绒毛消失。流式细胞术是检测细胞凋亡的一种重要方法，通过ＰＩ染色法，流式细胞仪能检测到与ＰＩ标记细胞ＤＮＡ结合的ＰＩ的荧光强度可直接反映细胞内ＤＮＡ的含量，可以检测目标细胞内的ＤＮＡ含量，区分细胞周期各时相。研究显示，随着ＭＹＲ浓度的增加，ＨｅｐＧ２细胞的亚二倍体细胞逐渐升高，并能在一定浓度范围内将细胞增殖阻滞在Ｇ２／Ｍ期，表现出细胞周期特异性；提示ＭＹＲ能够减慢ＨｅｐＧ２细胞分裂速度，阻止其由Ｇ２／Ｍ 期向Ｇ０／Ｇ１和Ｓ期移行，从而抑制ＨｅｐＧ２细胞增殖。从表２可见，人肝癌ＨｅｐＧ２细胞经ＭＹＲ作用后，随着ＭＹＲ浓度的增加，凋亡细胞比例也逐渐增多。 目前认为，细胞凋亡的信号转导与３条途径有关，一条是线粒体途径，由线粒体感受伤害刺激信号后释放一系列凋亡信号分子，引发ｃａｓｐａｓｅ反应导向凋亡，其中线粒体是细胞凋亡调控中心［１１］；另一条是死亡受体途径，由死亡受体结合配体后直接激发ｃａｓｐａｓｅ级联反应［１２］；还有一条内质网途径，目前机制不甚明确，估计与内质网应激诱导ｃａｓｐａｓｅ反应有关［１３］。本实验发现人肝癌ＨｅｐＧ２细胞经ＭＹＲ处理后，细胞内的线粒体膜电位明显下降，ｃａｓｐａｓｅ３和ｃａｓｐａｓｅ９活性也明显增加。 诱导细胞凋亡是抗肿瘤药物发挥作用的重要环节。本研究结果表明ＭＹＲ能有效诱导人肝癌ＨｅｐＧ２细胞凋亡，并可能通过线粒体途径实现，为进一步研究ＭＹＲ抗肿瘤作用的分子药理机制提供了实验依据。但是ＭＹＲ诱导ＨｅｐＧ２细胞凋亡是否还存在其他重要机制还有待于更进一步的研究。 ［１］ 常徽，糜漫天植物黄酮抗肿瘤研究进展［Ｊ］国外医学·卫生学分册，２００６，３３（５）：２９６ ［２］ ＫｏＣＨ，ＳｈｅｎＳＣ，ＨｓｕＣＳ，ｅｔａｌＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙｍｙｒｉｃｅｔｉｎ：ｒｏｌｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ，ａｎｄｃａｓｐａｓｅｃａｓｃａｄｅ［Ｊ］． ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍ，２００５，６９（６）：９１３ ［３］ 刘薇，林文翰，季宇彬青龙衣毒性作用及体外抗肿瘤作用的实验研究［Ｊ］中国中药杂志，２００４，２９（９）：８８７ ［４］ 张小晶，刘云鹏，侯科佐，等紫杉醇诱导黑色素瘤细胞凋亡的研究［Ｊ］中国医科大学学报，２００６，３５（２）：１３４ ［５］ 冯骥良，温巧莲，何伟玲，等白藜芦醇以Ｃａｓｐａｓｅ依赖和非依赖两种方式导致Ｊｕｒｋａｔ细胞死亡［Ｊ］细胞生物学杂志，２００７，２９：１０３ ［６］ 陈立军，靳秋月，王瑞珉，等芸香苷诱导Ｋ５６２细胞凋亡机制［Ｊ］中草药，２００６，３７（５）：７３８ ［７］ 徐开屏，孙凤艳线粒体释放的促凋亡蛋白和细胞凋亡［Ｊ］中国神经科学杂志，２００２，１８（４）：７３２ ［８］ ＮｅｗｍｅｙｅｒＤ，ＦｅｒｇｕｓｏｎＭＳＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ｒｅｌｅａｓｉｎｇｐｏｗｅｒｆｏｒｌｉｆｅａｎｄｕｎｌｅａｓｈｉｎｇｔｈｅｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓｏｆｄｅａｔｈ［Ｊ］Ｃｅｌｌ，２００３，１１２（４）：４８１ ［９］ ＫｏＣＨ，ＳｈｅｎＳＣ，ＬｅｅＴＪＦ，ｅｔａｌＭｙｒｉｃｅｔｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ［Ｊ］ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ，２００５，４（２）： ２８１ ［１０］ ＺｈａｎｇＱ，ＺｈａｏＸＨ，ＷａｎｇＺＪＦｌａｖｏｎｅｓａｎｄｆｌａｖｏｎｏｌｓｅｘｅｒｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｎａｈｕｍａｎｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅ（ＯＥ３３）ｂｙｃａｕｓｉｎｇＧ２／Ｍａｒｒｅｓｔａｎｄｉｎｄｕｃｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］ ＦｏｏｄＣｈｅｍＴｏｘｉｃｏｌ，２００８，４６（６）：２０４２ ［１１］ ＭａｒｔｉｎｏｕｓＪＣ，ＤｅｓａｇｈｅｒＳ，ＡｎｔｏｎｓｓｏｎＢＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ａｌｌｏｒｎｏｔｈｉｎｇ［Ｊ］ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０００，２（３）：４１ ［１２］ ＪｏｈｎｓｔｏｎｅＲＷ，ＲｕｅｆｌｉＡＡ，ＬｏｗｅＳＷＡｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ａｌｉｎｋｂｅｔｗｅｅｎｃａｎｃｅｒｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］Ｃｅｌｌ，２００２，１０８（２）：１５３ ［１３］ ＮａｋａｇａｗａＴ，ＺｈｕＨ，ＭｏｒｉｓｈｉｍａＮ，ｅｔａｌＣａｓｐａｓｅ１２ｍｅｄｉａｔｅｓｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｐｅｃｉｆｉｃａｐｏｐ ｔｏｓｉｓａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｂｙ ａｍｙｆｏｉｄｂｅｔａ［Ｊ］Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３（６７６５）：９８ 杜仲提取物 绿原酸 金银花提取物 苦杏仁苷 枇杷叶提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科罗索酸 淫羊藿苷 二氢杨梅素 獐牙菜苦苷 杨梅素 10-羟基喜树碱 7-乙基-10羟基喜树碱 上禾生物 专注植提 精于高纯 基于您对天然产物需求持续创新 |
