绿原酸人工抗原的合成及反应条件的优化 | 绿原酸人工抗原的合成及反应条件的优化 |
| 发布时间:2011-04-22 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:4433 |
［摘要］ 目的：制备中药成分绿原酸（ＣＧＡ）的人工抗原，并优化合成反应条件，为中药注射剂不良反应的深入研究提供物质基础和技术基础。方法：采用碳二亚胺法，将ＣＧＡ与载体蛋白牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶联起来制得完全抗原（ＣＧＡＢＳＡ）；正交法优化合成反应条件；经基质辅助激光解吸飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）和紫外吸收光谱（ＵＶ）测定其偶联率（Ｍｒ）。结果：ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ和ＵＶ测得合成的人工抗原ＣＧＡＢＳＡ的Ｍｒ分别为２０和１８８；反应最佳条件为ＮＨＳ，ＥＤＣ，ＢＳＡ与ＣＧＡ的比率为４∶１，１∶１，１∶２００，ｐＨ为９。结论：成功合成了绿原酸全抗原（ＣＧＡＢＳＡ），为进一步深入研究绿原酸的过敏原性及其相关性研究提供物质基础。 ［关键词］ 绿原酸；基质辅助激光解吸飞行时间质谱；完全抗原 中药注射液不良反应主要为Ｉ型变态反应，变态反应相对较多地出现在清热解毒类的中药注射剂中，首先与这些品种较高的临床应用率是相关的，其次跟它们共有的内在主要成分绿原酸（ＣＧＡ）是否相关，是否是其致敏原的问题，越来越受到关注和重视，值得笔者深入探讨。ＣＧＡ在众多的中药注射剂如双黄连注射液、茵栀黄注射液、银黄注射液、清开灵注射液等中均存在，具有抗菌、抗病毒、利胆等作用，是中药抗感染类注射剂的有效成分之一。由于ＣＧＡ是植物次生代谢产物，在植物中广泛分布，从厥类植物到高等双子叶植物均有报道，且其极性较大，水溶性较好，虽然ＣＧＡ在一些注射剂中不是活性成分，但工艺中有可 能未将其除去而含有ＣＧＡ［１］。从ＣＧＡ的结构、存在形式、理化性质分析，存在致敏的可能。相对分子质量低于１０００的化合物，可以与蛋白质结合形成半抗原载体复合物，有人认为，以ＣＧＡ为代表的邻苯二羟基类成分是半抗原物质，经一定反应，与蛋白质的结合后具有致敏性；１５～１８分子或４０分子的ＣＧＡ（２种反应机制）与１分子人类血清蛋白结合，成为具有高度抗原性的结合物［２４］，也有研究者认为，绿原酸不具有致敏作用［５６］。虽然ＣＧＡ是否为变应原尚无确切定论，但凡是含有ＣＧＡ且供静脉滴注用的中药注射剂，容易发生过敏反应，却是不争的事实。 本研究通过制备ＣＧＡ与蛋白的结合物，即合成绿原酸全抗原（ＣＧＡＢＳＡ），设计讨论其反应条件的优化；并采用紫外光谱和基质辅助激光解吸飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）测定其偶联率（Ｍｒ），为进一步深入研究中药注射剂不良反应（主要是Ｉ型变态反应）的相关性基础研究提供物质基础。 １ 材料与方法 １．１ 试剂与仪器 ＣＧＡ（纯度≥９８.０％，北京化学试剂公司）；牛血清白蛋白（ＢＳＡ，北京索莱宝科技有限公司）；碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ·ＨＣＬ纯度≥９９.０％，北京化学试剂公司）；Ｎ羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ）；二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）均为分析纯，北京化学试剂公司；磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ７.２，０.０１ｍｏｌ·Ｌ１）；ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ（美国布鲁克道尔顿有限公司）；紫外可见分光光度计（ＵＮＩＣＯ２８００，美国）。 １．２ ＣＧＡＢＳＡ合成方法ＣＧＡＢＳＡ人工抗原的合成参照文献［７］方法进行，ＣＧＡ １７.０ｍｇ，ＥＤＣ· ＨＣＬ４２.０ｍｇ，ＮＨＳ１８.０ｍｇ，溶解于３ｍＬＤＭＦ中，避光密封，室温反应２４ｈ后得Ａ液；ＢＳＡ５０.０ｍｇ溶于７ｍＬＰＢＳ中为Ｂ液。然后将Ａ液逐滴加入Ｂ液中，密封避光４℃下搅拌过夜；上述反应完成后，反应液转移至透析袋于４℃搅拌下用ＰＢＳ透析３ｄ；经冻干处理，即得到ＣＧＡＢＳＡ复合物，于－２０℃保存备用合成路线见图１。
１．３ 合成条件的优化 分析影响合成的所有因素，确定其主要因素有ＮＨＳ，ＥＤＣ及ＢＳＡ与ＣＧＡ的比例（摩尔比），以及反应体系的ｐＨ，设计Ｌ９（３４）的正交试验表进行试验。 １．４ ＣＧＡＢＳＡ人工抗原偶联率的计算 １．４．１ 基质辅助激光解吸飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）［８］ 供试品处理：称取ＣＧＡＢＳＡ０６ｍｇ，溶于８ｍｏｌ·Ｌ－１的尿素３０μＬ中，然后将它稀释成适当的浓度。称取ＢＳＡ１０ｍｇ溶于水５０μＬ。基质辅助溶液的配制：将０１５％ＴＦＡ３４μＬ加到乙腈１７μＬ中，再加入适量的芥子酸使溶液达到过饱和状态，超声１５ｍｉｎ，１０００ｒ· ｍｉｎ－１离心３ｍｉｎ，备用。 ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ测定：各取供试品和基质辅助溶液１μＬ，充分混匀，吸取混合液１μＬ滴加在金属点样板上，室温凉干后，上ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ测定。 ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ的仪器工作条件为：Ｎ２激光３３７ｎｍ，４次／ｓ脉冲，加速电压２０ｋＶ，真空度５×１０－９ＫＰａ，真空管长度为１５ｍ，线性模式下操作，所得数据用ＢｒｕｋｅｒＸＭＡＳＳ软件分析。 １．４．２ 紫外吸收光谱法 制备不同质量浓度 （３２，６４，１２８，２５６，５１２ｍｇ·Ｌ－１）ＣＧＡ对照品溶液，在２７８ｎｍ处测定紫外吸收值，得回归方程。 对偶联物（２００ｍｇ· Ｌ－１），ＢＳＡ对照品溶液（２００ｍｇ· Ｌ－１）进行紫外扫描，水为对照。ＣＧＡＢＳＡ为２００ｍｇ·Ｌ－１，在２７８ｎｍ处吸收值为Ａ１，ＢＳＡ为２００ｍｇ·Ｌ－１时，在２７８ｎｍ处的吸收值为Ａ２，那么Ａ１～Ａ２则是ＣＧＡ在此波长处的贡献。根据回归方程可得出偶联物中对应的ＣＧＡ的质量浓度，根据公式即可计算出Ｍｒ。
２ 结果 ２．１ ＣＧＡＢＳＡ人工抗原的ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ鉴定图２和图３分别为ＢＳＡ和ＣＧＡＢＳＡ的质谱图。可知ＢＳＡ的相对分子质量为６６２９８，ＣＧＡＢＳＡ 的相对分子质量为７３５３８，已知ＣＧＡ的相对分子质量为３５４，该结果表明ＣＧＡＢＳＡ中，每个载体蛋白ＢＳＡ分子上偶联有２０个［（７３５３８－６６２９８）／３５４≈２０］ＣＧＡ分子，人工抗原的合成成功可用于进行相应的变态反应基础研究。
２．２ ＣＧＡＢＳＡ人工抗原的紫外分析不同浓度ＣＧＡ对照品溶液在２７８ｎｍ处的紫外吸收值，以质量浓度Ｃ（ｍｇ·Ｌ－１）为横坐标，吸光度Ａ为纵坐标，计算回归方程。结果表明ＣＧＡ在３.２～５１.２ｍｇ·Ｌ－１的紫外吸收值与浓度有很好的线性关系，回归方程为Ａ＝０.０２５３Ｃ－０００１２，ｒ＝０.９９９９。 合成的ＣＧＡＢＳＡ人工抗原Ａ１ ＝０６３０，ＢＳＡＡ２＝０.１０６，根据公式Ａ１－Ａ２＝０.５２４，根据回归方程Ａ＝０.０２５３Ｃ－０.００１２，ｒ＝０.９９９９，可得出偶联物中对应的ＣＧＡ的质量浓度２０.７ｍｇ·Ｌ－１，得出Ｍｒ约为１８.８（１８.８∶１）。 ２．３ 抗原合成条件的优化结果 从研究数据得出，无论ＥＤＣ与ＣＧＡ比例是１∶１，２∶１还是４∶１，其中的ＥＤＣ都是等量或充分过量的，ＣＧＡ几乎可以完全反应，所以对反应的影响最小；ＮＨＳ与ＣＧＡ的比例增加，Ｍｒ也在增加；本实验中ｐＨ为９时，Ｍｒ的范围均在理想的推荐范围（５∶１～２０∶１），确定反应体系的最佳ｐＨ为９。 ３ 讨论 国内外对ＣＧＡ的研究主要集中在药效学研究，而对ＣＧＡ致敏性的研究，国外研究集中在２０世纪６０年代，加拿大的Ｆｒｅｅｄｍａｎ研究小组和美国的Ｌａｙｔｏｎ研究小组对ＣＧＡ的致敏性进行了研究，并在此期间发表了系列文献，他们对于ＣＧＡ是否为变应原呈相反的两方面意见，前者认为是变应原，而后者认为不是变应原。对上述２个小组的研究文献综合分析，对于ＣＧＡ是否为变应原尚无确切定论。缺乏系统的试验；受试物的纯度问题；试验方法不同等，可能是导致双方结果不一致的原因［３，６］。以后对此问题基本无报道，国内则无相关报道。 ＣＧＡ是一种羧基半抗原，相对分子质量为３５４.３０，低于１０００，本身并不具备免疫原性，必须将其与具有免疫原性的载体蛋白相偶联生成完全抗原［９］。本研究将绿原酸（ＣＧＡ）与载体牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶联，制备ＣＧＡ与蛋白的结合物，即合成绿原酸全抗原（ＣＧＡＢＳＡ），为观察ＣＧＡＢＳＡ的致敏作用提供物质基础，确定ＣＧＡ是否为变应原。 对于羧基半抗原与载体的偶联，传统的人工抗原的合成方法有混合酸酐法、活泼酯法及碳二亚胺法。本实验采用碳二亚胺法合成ＣＧＡＢＳＡ，由于ＣＧＡ分子结构中的羧基可用于偶联反应，采用碳二亚胺法合成方案的优点是可以避免载体蛋白自身的氨基和羧基在交联剂作用下发生的自身交联，从而最大程度地减少反应副产物的生成促进剂，偶联效果较好。 然而，抗原的免疫原性不仅与抗原的分子结构大小有关，还与半抗原与载体蛋白偶联率的大小有关。连接过多的半抗原，并不意味着实际的免疫效果就一定好，半抗原与载体的偶联比（Ｍｒ）存在着最佳范围（５∶１～２０∶１）［１０］，为得到理想偶联率的高免疫原性全抗原，笔者对合成条件进行了的多次优化试验。本实验中，反应中ｐＨ的变化会使反应中蛋白质不稳定产生沉淀析出，ＮＨＳ直接影响取代从而影响蛋白质和抗原的连接，结合反应中出现的现象及实验数据分析，ＮＨＳ的量和ｐＨ是影响偶联率的重要因素，因此，４个影响因素作用的大小顺序是ＮＨＳ与ＥＤＣ的比＞反应的ｐＨ＞ＣＧＡ与ＢＳＡ的比＞ＥＤＣ与ＣＧＡ的比。笔者认为本反应的最佳条件是：ＮＨＳ，ＢＳＡ，ＥＤＣ与ＣＧＡ的比分别为４∶１，１∶２００和１∶１及反应的ｐＨ为９，以此条件合成的ＣＧＡＢＳＡ，其半抗原与载体蛋白的结合比从２∶１升高至１４∶１。 此外，本实验采用ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ测定人工抗原ＣＧＡＢＳＡ的Ｍｒ，与传统的鉴定方法紫外光谱扫描法进行了比较，ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ技术具有高灵敏度，供试品消耗量低，结果直观、准确（误差小于０２％）的优点，现有紫外光谱扫描法对ＣＧＡＢＳＡ复合物的测定，操作较简单易行、但所需样品量多，误差也较大；结果表明２种方法测得的数据比较接近，但是ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ结果更为精确、可信。 ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ法是比较理想的用于生物大分子的鉴定分析方法［８］。 本研究合成效率较高，合成方法简便可行，为进一步对ＣＧＡ的致敏性及其发生机制、毒理学进行系统深入的研究，为寻找合适、敏感的方法对中药注射剂变态反应的研究提供了物质基础，也可为其他小分子物质的人工抗原合成提供参考。 ［参考文献］ ［１］ 赖宇红，陈浩桉，杨卫荣．中药注射剂变态反应研究亟待加强［Ｊ］．中药新药与临床药理，２００２，１３（５）：３２４． ［２］ ＦｒｅｅｄｍａｎＳＯ．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ［Ｊ］．ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，１９６４，３５：９７． ［３］ ＦｒｅｅｄｍａｎＳＯ，ｅｔａｌ．Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ：ａｎａｌｌｅｒｇｅｎｉｎｇｒｅｅｎｃｏｆｆｅｎｂｅａｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９６１，１９２：２４１． ［４］ 杨慧，刘志刚，韩庆国，等．艾蒿、青蒿花粉变应原组分的研究 ［Ｊ］．免疫学杂志，２００４，２０（２）：１２０． ［５］ ＬａｙｔｏｎＬＬ．Ｃａｓｔｏｒｂｅａｎａｌｌｅｒｇｙａｓｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｔｈｅｓｐｕｒｇｅｓ （Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）：ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎｔｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｉｎｐｒｉｍａｒｙａｌｌｅｒｇｙｔｏｃａｓｔｏｒｂｅａｎ［Ｊ］．ｌｎｔＡｒｃｈＡｌｌｅｒｇｙ，１９６３，２３：２２５． ［６］ ＬａｙｔｏｎＬＬ．Ｎｏｎｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓａｍｐｌｅｓｏｆｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｃａｕｓｉｎｇａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｐｕｒｅｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｎｏｔａｎａｌｌｅｒｇｅｎ［Ｊ］．ＪＡｌｌｅｒｇｙ，１９６６，３５（５）：２６８ ［７］ 孙武勇，刘向辉，屈凌波，等．阿莫西林完全抗原的合成与鉴定［Ｊ］．郑州大学学报，２００７，４２（１）：７２． ［８］ 蔡碧双，邵幼岩，林纪昀，等．甘草酸人工抗原的合成鉴定及免疫原性分析［Ｊ］．中国生化药物杂志，２００８，２９（１）：１９． ［９］ 余若祯，何苗，施汉昌，等．２，４Ｄ完全抗原的合成及其免疫性能评价［Ｊ］．环境科学，２００６，２７（１）：１４６． ［１０］ 杨利国，胡少昶，魏平华，等．酶免疫测定技术［Ｍ］．南京：南京大学出版社，１９９８：２８０．
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