（袁丹胡爽 杜慧琴 毕开顺 沈阳药科大学；王瑞杰 沈阳东宇工业技术研究院）

关键词：薄层色泽法；高效液相色谱法

摘要：目的建立橘红丸中苦杏仁苷的定性、定量分析方法。方法采用薄层色谱法对橘红丸中苦杏仁苷进行定性鉴别；并用高效波相色谱法测定苦杏仁苷的含量。结果在橘红丸薄层色谱中，展开剂：为氯仿-甲醇-冰醋酸-水（20:10:3:1），可清晰检出苦杏仁苷班点；HPLC测定橘红丸中苦杏仁苷含量，苦杏仁苷线性范田1.1～18.0μg（r=0.9998），平均回收率为97.3% （RSD=2.8％），灵敏度高，结呆准确，重视性好。结论方法简便可行，可用于该制剂的质量控制。

    橘红丸收载于中国药典2000年版一部中，由化橘红、陈皮、半夏、苦杏仁和甘草等15味药材组成；具有清肺、化痰、止咳之功效。用于治疗咳嗽痰多，痰不易出，胸闷口干。现代研究表明，该方中配伍药材苦杏仁治疗咳喘的有效成分为苦杏仁苷，少量口服时，该成分在苦杏仁酶及肠道菌丛中的β葡萄糖苷酶作用下产生微量氢氰酸，刺激呼吸中枢产生镇咳作用，大量则会产生氰中毒症状甚至死亡。同时日本汉方制剂规格试验项目中，苦杏仁苷为苦杏仁、桃仁配伍制剂的定量指标成分。本实验对橘红丸中的苦杏仁进行苦杏仁苷的TLC鉴别和HPLC含量测定，将对该制剂质量控制及确保用药安全有效具有科学的意义。

    1仪器和试药

    高效液相色谱仪（LC-6A泵，SPD-6A紫外检测器，CTO-6A柱温箱，C-R6A数据处理机，日本岛津公司）；B-5200型超声波机（日本Yamata公司）；SHA-C型恒温水浴振荡器（江苏常州国华电器有限公司）；H-26F离心机（日本Kokusan株式会社）；HSGF254薄层板（烟台化工研究所）；有机溶媒微孔滤股，孔径0.45μm，规格φ13mn（天美仪器有限公司）。

    苦杏仁苷对照品（纯度98．5％以上，和光纯药工业株式舍社，日本）；橘红丸A：自制模型制剂；B， C和D：三种商品制剂。所用药材及商品制剂购自沈阳天益堂等药店，经本室许春最高级工程师鉴定均为正品药材。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

    2方法与结果

    2.1薄层色谱鉴别

    2.1.1供试溶液的制备按药典处方量制备橘红丸模型制剂A（6．0g/丸），称取13．5g，加5倍量甲醇超声提取（42kHz）15min，离心（3500 r·min-1） 15min，取上清液浓缩至干，残渣加水20mL溶解，以等量正丁醇萃取，取上层液10mL蒸干，残渣以 2．5mL甲醇溶解，即为供试品溶液。

    3种市售商品制剂B，C，D分别在60℃干燥8 h。粉碎，称取27.0g，按上法制备供试品溶液。

    按处方量制备缺苦杏仁的阴性对照品，称取 12．5g，按上法制备阴性对照溶液。

    取苦杏仁粗粉1．0g，加甲醇10mL超声提取（42kHz）15min，离心（3500r·min-1）15min，取上清液即为药材供试品溶液。

    称取苦杏仁苷对照品3mg，加甲醇1mL溶解，制成苦杏仁苷对照品溶液。

    2．1．2薄层色谱取苦杏仁苷对照品溶液、苦杏仁药材、模型及商品橘红丸供试液和阴性对照液各3 μL，分别点于同一薄层板（HSGF254）上，以氯仿-甲醇-冰醋酸-水（20:10:3:1）为展开剂，上行展开8 cm，取出晾干，喷以茴香醛硫酸溶液，在105℃下烘 5min。结果显示：苦杏仁对照药材，橘红丸供试品 A，B在Rf值0．51处均可检出暗绿色苦杏仁苷斑点，而阴性对照液无此斑点（图1）。

    2．2含量测定

    2．2．1色谱条件色谱柱：Hypersil C18柱（4．6mm ×250mm，5μm）；流动相：甲醇-乙腈-水-冰醋酸（1: 1:16:0.02）；检测波长：210nm；流速：0.8mL· min-1；柱温：40℃；进样量：10μL。

    2．2．2对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥2h的苦杏仁苷对照品36mg，加甲醇溶解、定容至20mL，摇匀，即得苦杏仁苷对照品溶液。

    2.2.3供试品溶液的制备橘红丸模型制剂A及三种市售商品橘红丸B，C，D各取5丸剪碎，分别于 60℃干燥8h，研磨混匀，精密称取7．0g，于加盖离心管中加甲醇10mL超声提取（42kHz）15min后， 40℃恒温水浴振荡15min，离心（3500r·min-1）15 min，上清液移至20mL量瓶中，洗涤残渣，合并洗液，定容，微孔滤膜滤过，续滤液即为各制剂供试波。

    2.2.4阴性对照液的制备按处方量制备缺苦杏仁药材的橘红丸样品，依照"2.2.3"项下制备防性对照液。

    2．2．5空白试验精密吸取苦杏仁苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液各10μL，分别注入液相色谱仪，在"2.2.1"色谱条件下测定，记录色谱图（图 2）。在橘红丸模型制剂供试液色谱图中，与对照品色谱图相应位置（tR=14.87min）上，确认了苦杏仁苷吸收峰，而阴性对照液色谱图无苦杏仁苷的色谱峰，故认为无干扰。

    2．2．6线性关系考察将上述苦杏仁苷对照品溶液粘释成不同系列浓度的对照溶液，在上述色谱条件下分别进样测定，以进样具（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，回归方程为：Y= 29043X+4103．6，r=0．9998（n=5），线性范围： 1．10～18．4μg。

    2．2．7精密度试验取精密称取橘红丸模型制剂 7．0g，按"2．2．3"项下制备供试液，按上述色谱条件连续测定4次，计算苦杏仁苷含量，所得RSD= 1．9％。

    2．2．8稳定性试验取"2．2．7"项下橘红丸模型制剂供试液配制后0.5，2，4，6h时进样，按上述色谱条件测定苦杏仁青峰面积分别为171572，168546， 165280，165451，计算RSD=1．8％，证明苦杏仁苷含量在6h内是稳定的。

    2．2．9回收率试验精密称取已知含量的橘红丸模型制剂粉末3．5g4份，精密加入苦杏仁苷对照液适量，按"2．2．3"项下制备供试液，依法测定，计算平均回收率为97．3％， RSD=2．8％。结果见表1。

    2．2．10样品测定取橘红丸模型制剂及商品制剂各供试溶液10μL，采用上述HPLC测定苦杏仁苷含量。结果见表2。

    3讨论

    表1回收率的测定结果n=3

    Tab Recovery results of the assay.n=3

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测定次数  样品量   苦杏仁苷    苦杏仁苷   测定值  回收率  平均值  RSD

          /g       含量/mg     加入量/mg  /mg     /%      /%      /%

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1         3.5318   5.527       5.52       10.700  93.7

2         3.5217   5.511       5.52       10.871  97.1    97.3    2.8

3         3.4969   5.473       5.52       10.866  97.7

4         3.5071   5.489       5.52       11.036  100.5

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    表2橘红丸中苦杏仁苷的含量测定结果n=3

    Tab Contents of amygdalin in Juhong pill.n=3

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样品        样品量     A        苦杏仁苷含量/mg·丸-1  RSD%

           /g                  测定量       平均值

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模型制剂A   6.9223     164795   9.59

            7.3106     169361   9.34         9.39                 1.9

            6.9419     159514   9.25

商品制剂B   7.2316     98971    5.41

            6.9087     93225    5.33         5.34                  1.2

            6.9502     92920    5.28

C           7.1044     Trace

            6.9210     Trace

            6.9986     Trace

D           6.9811     Trace

            7.1019     Trace

            7.2106     Trace

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    3．1本实验考察了橘红丸中苦杏仁苷在甲醇及不同比例的甲醇-水中的提取率，表明甲醇提取效率最高，故选择甲醇作为提取溶剂。比较不同提取方法（超声、恒温水浴振荡、超声+恒温水浴振荡）的提取效率，选择了超声振荡15min，使样品完全分散，再恒温水浴振荡15min，提取效率最高，且操作简便。

    3．2苦杏仁苷的定量方法文献报道有薄层扫描法、气相色谱法和高效液相色谱法等。考察了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水为流动相时苦杏仁苷在制剂中的分离效果。由于苦杏仁苷的龙胆双糖部分有较多醇羟基，加入冰醋酸起离子抑制作用，最终确定以甲醇-己腈-水-冰醋酸（1： 1:16:0.02）进行分析，苦杏仁苷与相邻峰达到基线分离，保留时间适宜。

    3.3.3种市售橘红丸，仅有一种在线性范围内定量，另外2种苦杏仁苷的含量在1.0mg·丸-1以下或微量，表明目前含苦杏仁的丸剂质量控制水平较低。

    3．4本实验采用的薄层色谱法鉴别，操作简便，显色灵敏，无干扰斑点，图谱清晰，为一较理想的复方制剂中苦杏仁苦的TLC鉴别法。