黄芳华

(国家食品药品监督管理局药品审评中心, 北京100038)

　近些年来,中药注射剂的安全性问题引起广泛关注,不良反应中变态反应占了很大比重,寻找引起不良反应的原因是亟待解决的问题。绿原酸在众多的中药注射剂中存在,有着广泛的药理作用,但是它又是一种可疑的致敏物质,因此,如何考虑绿原酸的利和弊、关注绿原酸的安全性问题,是研发者、生产者和审评人员均应关注的问题。在这种情况下,作者通过文献调研,对绿原酸致敏性研究概况进行总结,对其致敏性进行分析,并提出以后需进一步研究的一些问题和建议。

1　绿原酸概况

1.       1　结构　

绿原酸( chlorogenic acid, CA) ,分子式C16H18O9 ,相对分子质量354130,是由咖啡酸( caffeic acid) 与奎尼酸( quinic acid, 12羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸,异名咖啡鞣酸,系统名1, 3, 4, 52四羟基环己烷羧酸2(3, 42二羟基肉桂酸酯) ,化学名32O2咖啡酰奎尼酸( 32O2caffeoylquinic acid) ,是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。

绿原酸由奎尼酸和咖啡酸缩合而成,根据咖啡酰在奎尼酸上的结合部位和数目不同,从理论上讲,单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所组成的绿原酸异构体共有10种,分别为12咖啡酰奎尼酸、32咖啡酰奎尼酸、42咖啡酰奎尼酸、52咖啡酰奎尼酸、1, 32二咖啡酰奎尼酸、1, 52二咖啡酰奎尼酸、1,62二咖啡酰奎尼酸、3, 42二咖啡酰奎尼酸、3, 52二咖啡酰奎尼酸、4, 52二咖啡酰奎尼酸。但到目前为止,从植物中发现的绿原酸异构体有绿原酸( 32咖啡酰奎尼酸) 、隐绿原酸(Band510) (42咖啡酰奎尼酸) 、新绿原酸(52咖啡酰奎尼酸) 、异绿原酸A (4, 52二咖啡酰奎尼酸) 、异绿原酸B (3, 42二咖啡酰奎尼酸) 、异绿原酸C ( 3, 52二咖啡酰奎尼酸) 、莱蓟素( 1,32二咖啡酰奎尼酸) [ 1 ]。

1. 2　理化性质　绿原酸半水合物为白色或微黄色针状结晶,在110 ℃时变为无水物,与稀盐酸共热产生咖啡酸,熔点208 ℃,比旋光度[α]D = 3512°(C = 218) 。绿原酸在25 ℃时水中溶解度约为4% ,易溶于乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂,微溶于醋酸乙酯,难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯,其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚3个不稳定部分。在从植物提取过程中,往往通过水解和分子内酯基迁移而发生异构化。由于绿原酸的特殊结构,决定了其可以利用乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂从植物中提取出来,但是由于绿原酸本身的不稳定性,提取时不能高温、强光及长时间加热。绿原酸的供试液放置于棕色瓶、冰箱(2 ℃)保存时最为稳定[ 2 ]。

1. 3　分布　绿原酸在植物中广泛分布,从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道,但含量较高的植物不多,主要存在于杜仲科、忍冬科忍冬属Lonicera L. 、菊科蒿属A rtem isia L. 植物中,包括杜仲、金银花、向日葵、继花、咖啡和可可树等。

1. 4　药理作用　绿原酸被认为是众多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分,通常被作为定性甚至定量的指标。

据报道,绿原酸的主要生物活性有: ①对透明质酸酶及葡萄糖262磷酸酶的抑制作用; ②对自由基的清除及抗脂质过氧化作用; ③抗诱变作用; ④保肝利胆作用; ④抗菌、抗病毒及解痉等作用。

2　含绿原酸的中药注射剂概况

在清热解毒类的中药注射剂处方中,以下的药材均含绿原酸:金银花、忍冬藤、鱼腥草、茵陈、栀子等。作者曾对目前已上市的呼吸系统中药注射剂进行分析,统计了20个复方制剂,药味出现频率以金银花(或其提取物)最高,共有12个,占60% ,鱼腥草、栀子等也有较高频率,说明含有绿原酸类成分的药味出现频次较高。

近些年来中药注射剂的不良反应报道较多,对已上市的17个呼吸系统中药注射剂进行文献分析,不良反应最多者为过敏反应,占报道文献的约90%。而且过敏反应也表现多样,程度不一,如皮肤瘙痒、皮疹、药热、过敏性哮喘、急性肺水肿,严重者过敏性休克,直至死亡。

3　绿原酸致敏性研究概况

2006年4月11日在CHKD期刊全文库以“绿原酸”为关键词进行检索,时间范围为1994～2006年,共检出583篇,其中药效5篇,药代相关3篇(含一篇与氨苄青霉素作用的药代相互影响) 、综述3篇(2篇非针对绿原酸而是针对中药注射剂的不良反应的综述) ,无一篇真正绿原酸的毒理研究文献。2008年9月5日再次检索,在该库中共检出968篇文献,仍无绿原酸的毒理研究文献。

检索国外文献,目前多为药效研究报道,如对免疫功能的影响、抗炎作用、抗诱变、心血管、保肝利胆、抗菌、抗病毒等方面。

关于绿原酸致敏性的研究,国外研究集中在20世纪60年代,此后基本无报道;国内则无相关报道。研究绿原酸致敏性的起因在于暴露于咖啡豆粉尘中的咖啡厂工人经常发生呼吸道哮喘、鼻炎或皮炎,进而引起大家兴趣,对引起过敏反应的原因进行了一系列的研究。分析文献,主要为2个研究小组———加拿大的Freedman研究小组和美国的Layton研究小组对绿原酸的致敏性进行了研究,并在1961～1968年期间发表了一系列文献。以后对此问题基本无报道。该两小组对于绿原酸是否为变应原呈相反的两方面意见,前者认为是变应原,而后者认为不是变应原。

Freedman等人通过研究认为:绿咖啡豆的水提取液高度致敏,皮肤直接接触0102～5 mL的水溶液(含5 g·L - 1 )中产生明显的阳性水疱和红斑反应,水提取液通过Sephedex G- 25柱进行分离,发现中间部分可产生强烈的被动转移阳性反应,通过三氯化铁反应认为,致敏性活性物质中存在高浓度酚类化合物。对已知的咖啡中的酚类化合物进行了系统的评价,将可疑化合物注入已知对绿咖啡过敏的10个工人的皮肤中,只有绿原酸产生了阳性反应,在试验者中1μg的CA足以引起水疱和吞噬细胞突起的红肿反应。交叉中和试验则表明,绿咖啡的抗体可被CA中和,试验者认为该结果提示CA可能是绿咖啡中的主要过敏原[ 3 ]。因CA广泛存在于多种植物中, Freedman等人对其他含CA的植物蓖麻子和橙子进行了研究,蓖麻子有致敏性,如呼吸道症状、荨麻疹等,有报道称对于咖啡粉尘过敏的病人对蓖麻油也产生皮内阳性反应,对蓖麻油和绿咖啡过敏的大部分病人,对橙子也产生阳性的皮内反应。通过纸色谱和红外色谱分析方法进行研究,认为CA也是蓖麻油和橙子中的组分, CA可与蓖麻油和橙子水提取物得到完全的交叉中和反应[ 4 ]。对于口服CA常不引起过敏而静注或吸入引起过敏的现象,经过研究表明志愿者或家兔口服给予含绿原酸的浓黑咖啡,血中未检出CA,但家兔静注给药血中则可检出CA,因此推测CA进入哺乳动物组织通过胃肠道不能直接到达循环血,可能在肠中破坏或转化[ 5 ] 。对CA的过敏性进一步研究,家兔以CA2弗氏佐剂联合物致敏表现出明显的抗体形成,而仅以CA (不与弗氏佐剂结合)不产生抗体形成,对致敏的家兔进行皮内试验,可见Arthus型反应,ASA试验则表明致敏家兔心内注射CA攻击产生不平静、极度呼吸困难直到死亡, PCA试验(心内注射药物进行攻击)则表明当抗血清稀释度为1∶10, 1, 1∶100,1∶1 000时产生反应,稀释度为1∶5 000, 1∶1万不产生应。因CA为小分子物质,对于其致敏机理认为与磺胺嘧啶、氯胺2T等类似,即是半抗原物质,进入体内与蛋白结合,而产生致敏活性[ 6 ]。

对CA是否有致敏性持反方观点的主要为Layton研究小组。他们在猴身上进行试验, 2只猴子在蓖麻子过敏病人血清被动致敏部位以1%浓度CA进行攻击或以5%绿咖啡提取固形物溶液进行攻击,未产生反应,随后注入蓖麻子蛋白则产生明显反应;豚鼠身上进行的PCA反应试验也表明对CA、绿咖啡或脱敏的蓖麻油饮食未产生反应,而以蓖麻油子蛋白和大荨麻蛋白攻击可在豚鼠身上立即引起阳性反应,通过这些试验,Layton等人认为被动转移蓖麻子抗体血清的部位缺乏对CA和绿咖啡的反应,提示CA不是蓖麻子过敏的重要因素[ 7 ]。他们对绿咖啡的过敏性进行了研究,认为对蓖麻子蛋白在1∶10万稀释度下临床皮肤划痕试验阳性结果病人身上,只在2 /9对1∶100稀释度的绿咖啡提取物表现出强的阳性反应,而对1∶100的重结晶的绿原酸均未产生明显的皮肤反应;将敏感病人血清被动转移至猴,对于CCDCA(通过200管反向逆流制备而来)或MSCA (通过绿原酸的无水甲醇可溶部分制备而来)无反应,而对粗绿原酸样品有反应, 5 mg的绿咖啡的不扩散性的渗出物在所有对留存的绿咖啡过敏的病人的血清均产生强烈的反应[ 8 ]。进一步研究表明,采用化学分析方法如NMR等分析成分,认为CCDCA为CA,因此认为CA不是过敏原,采用法国和加拿大病人抗血清被动转移的P2K试验,对任何CA样品的可扩散者不产生反应,但是从绿原酸中分离而来的不扩散性的杂质( contami2nant)对绿咖啡过敏者的P2K试验可产生过敏,因此认为纯CA和绿咖啡中的扩散性物质不是过敏原,导致过敏者是绿原酸中分离而来的不扩散性的杂质( contaminant) [ 9 ]。另外,在志愿者和猴身上进行试验,志愿者(12个加拿大人和4个法国人)进行PK试验,皮肤致敏血清以1%的CCD2纯化的CA攻击,未产生反应; 4个加拿大人的血清致敏部位以1%商购的CA则产生明显反应; 7个以加拿大人血清被动致敏者,当1%绿咖啡残留物进行皮试时出现明显的水疱和发红。

在猴身上以加拿大人或法国人咖啡过敏者的血清被动致敏部位对CCD2纯化的CA或18 h绿咖啡渗出液不产生反应,通过以上试验Lyaton等认为真正致敏原是高分子物质[ 10 ]。对以上二者的分歧所带来的矛盾[ 11 ] , Layton L L认为在其研究中没有证据表明CA以半抗原形式存在,与人血清蛋白或牛血清蛋白甚至绿咖啡蛋白结合形成复合物而致敏[ 12 ]。但Freedman S O推测为:两者试验样品不一致是导致结果不一致的重要原因,并再次确定在他们所进行的试验中得到阳性结果,采用Layton L L的样品(CCD柱制备)重复其试验也得到与之相同的结果,认为CA常来源于咖啡和其他植物来源,在常温下暴露于空气中易氧化,而且指出他们的试验中只是说明CA是变应原,但是没有称CA是唯一的变应原[ 13 ]。

由于中药注射剂的特殊性,本中心将“含绿原酸中药注射剂的安全性问题”作为第一批与申办人共同研究的“共性问题”进行研究。网上的讨论意见中有进行了绿原酸的过敏试验研究,认为豚鼠主动过敏试验和大鼠被动过敏试验结果均为阴性。

4　对绿原酸的致敏性分析

通过以上文献综合分析,对于绿原酸是否为变应原尚无确切定论。首先,缺乏系统的试验,从上世纪60年代进行的有争议的两方面试验的争论焦点,可看出其中存在很多问题,如受试物的纯度问题、是否为其他成分的影响、试验方法有所不同等,可能是导致双方结果不一致的原因。另一方面,这些试验进行时间均较早,随着研究手段、试验方法、仪器设备均有较大进步,却对绿原酸的致敏性无相应系统、深入的研究。

在这种情况下,仅根据一方面的观点,简单认为绿原酸有或无过敏性均是不慎重的。其次,变态反应是一种复杂的反应,涉及多种因素,影响多个系统。现有的过敏试验有其局限性,如目前考察过敏性多采用全身主动过敏试验(ASA ) 和被动皮肤过敏试验( PCA) ,根据目前的研究状况,这些试验方法本身有一定局限性,不能做到完全预测致敏性,比如说有些在临床发现明确有致敏性的样品进行该试验结果却为阴性,或是在一些情况下需刺激强度较高时才能得出阳性反应。另一方面,根据目前不良反应情况分析,变态反应的发生与多种因素有关,如机体状态、过敏体质等因素有关,对于某一个药,不是所有的人都会发生过敏反应,发生的严重程度也不一致。而目前仍缺乏有效地预测过敏性的试验方法、缺乏反映过敏相关的各种免疫环节的试验。再次,从绿原酸的结构、存在形式、理化性质分析,存在致敏的可能。绿原酸为次生代谢产物,有众多异构体存在,绿原酸多从植物中提取而来,在提取过程中可能有一些同类物质或其他杂质,绿原酸本身又不稳定,在提取、纯化、贮存过程中可能会发生变化,因此对含绿原酸的中药注射剂而言,难以肯定其无致敏性。

而且,从目前中药注射剂不良反应发生的现状分析,无法排除绿原酸无致敏性。因为在清热解毒类药物中变态反应发生率较高,这其中有很多含有绿原酸。在目前中药注射剂的安全性受到关注的背景下,在缺乏研究的情况下应慎重对待。

综上分析,目前没有确切的证据说明或排除绿原酸是变应原(即具有致敏性) 。

5　需进一步明确的问题及建议

如前所述,目前无法排除绿原酸不是变应原,而中药注射剂成分复杂,绿原酸本身稳定性又较差,因此应用时可能带来安全性担忧。在这种情况下,建议加强绿原酸及相关中药注射剂的研究,研究开发时应慎重考虑,对已上市的中药注射剂也应继续进行深入研究。

进一步加强对绿原酸的基础研究。加强成分研究,如含量、异构体、同系物/同类型物质的研究,进行系统、深入的毒理学研究。

密切关注中药注射剂尤其是含有绿原酸的中药注射剂的安全性问题,加强研究。需加强立题时的考虑。中药注射剂安全性问题是中药注射剂开发时需首要关注的问题。此种剂型与传统中药的用药方法有极大差异,已不再等同于传统中药,根据目前应用状况分析注射剂的不良反应比口服制剂明显增加,因此,中药注射剂的立题应考虑全面,需定位于急重症,根据研究结果,对风险2获益进行充分权衡,考虑获益是否能超过风险。

中药注射剂应加强成分研究,在含绿原酸成分的情况下,因绿原酸本身的结构、形成特点和理化性质,应对绿原酸的含量、其他的成分尤其是同类物质进行研究,充分考虑可能带来不良反应的因素。

加强毒理研究,进行毒理研究时应考虑全面,如急毒、长毒等常规毒理学研究应注意观察仔细和全面,要加强与过敏反应相关的毒理学研究,尤其是对有可疑致敏者,应加强过敏反应试验研究。由于常规的全身主动过敏试验(ASA)和被动皮肤过敏试验( PCA)有其局限性,因此除常规的过敏试验外,建议进行与过敏反应相关的免疫因子、免疫过程等影响的研究。

加强对变态反应的研究,尤其是中药注射剂,寻找合适、敏感的方法来研究致敏性及其发生机理,为注射剂的开发和临床应用提供充分的信息。

[参考文献]

[ 1 ] 　尉　芹,马希汉. 绿原酸及其提取分离方法评述[ J ]. 中成药,2001, 23 (2) : 135.

[ 2 ] 　邓　良,袁　华,喻宗沅. 绿原酸的研究进展[ J ]. 化学与生物工程, 2005, 7: 4.

[ 3 ] 　Freedman S O, Krupey J, Sehon A H, et al. Chlorogenic acid:an allergen in green coffen bean[ J ]. Nature, 1961, 192: 241.

[ 4 ] 　Freedman S O, Siddiqi A I, Krupey J, et al. Identification of a simp le chemical compound (Chlorogenic acid) as an allergen in p lantmaterials causing human atop ic disease[ J ]. Am JMed Sci,1962, 244: 548.

[ 5 ] 　Freedman SO, Shalman R, Krupey J, et al. Loss of allergenicity of chlorogenic acid in the gastrointestinal tract[ J ]. J Allergy Clin Immunol, 1964, 35: 108.

[ 6 ] 　Freedman SO, Shalman R, Krupey J, et al. Antigenic p roperties of chlorogenic acid[ J ]. J Allergy Clin Immunol, 1964, 35: 97.

[ 7 ] 　Layton L L, Panzani R, Greene F C, et al. Castor bean allergy as hypersensitivity to the spurges ( Euphorbiaceae) : absence of reac2 tion to chlorogenic acid in p rimary allergy to Castor bean[ J ]. Int Arch Allergy, 1963, 23: 225.

[ 8 ] 　Layton L L, Greene F C, Panzani R, et al. Allergy to green cof2 fee: failure of patients allergic to green coffee bean to react to Chlorogenic acid, roast coffee, or orange [ J ]. J Allergy Clin Im2 munol, 1965, 36: 84.

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