淫羊藿提取物的雌激素样作用研究 | 淫羊藿提取物的雌激素样作用研究 |
| 发布时间:2011-02-28 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2832 |
于燕，颜虹，胡森科，张敬华 （西安交通大学医学院公共卫生系，陕西西安 710061） 【摘要】 目的评价淫羊藿提取物的雌激素样作用。方法 采用小鼠子宫增重实验、雌激素受体阳性细胞系(MCF7)细胞增殖及拮抗实验，评价淫羊藿及淫羊藿苷的雌激素样作用及其可能机制。结果与阴性对照组比较，淫羊藿及淫羊藿苷能使子宫系数由0.097±0.008明显增加至0.156±0.018及0.152±0.016，且用药前、后动物体重由(18.9±1.3)g分别增至(19.8±1.3)g及(20.03±1.3)g，增幅明显高于阴性对照组(P<0.05)；淫羊藿苷可使血清雌激素E2由(132.22±11.45)ng/L增高至(147.73±12.43)ng/L，FSH水平由(50.15±3.36)μg/L降低至(44.47±2.46)μg/L(P<0.05)，但淫羊藿组雌激素E2水平无明显改变；在24、48、72h，淫羊藿及淫羊藿苷对MCF7细胞的增殖均有明显的促进作用(P<0.05)，分别由0.238±0.043、0.387±0.051、0.563±0.083增至0.362±0.045、0.521±0.046、0.648±0.043及0.324±0.043、0.465±0.034、0.622±0.079；72h加入ICI后，细胞增殖明显受到抑制，细胞增值率分别降至99.461%、94.434%。结论 淫羊藿及淫羊藿苷具有雌激素样作用，且其促细胞增殖作用可能是通过雌激素受体(ER)介导产生的。
【关键词】 淫羊藿提取物 雌激素样作用
淫羊藿作为传统补肾壮阳药，具有显著的生物学活性[1]。体内药理实验研究显示，淫羊藿提取物具有性激素样作用，能使雌性小鼠子宫增重[2]，但其雌激素活性成分及作用机制尚不清晰。本实验选用淫羊藿苷含量较高的陕西产淫羊藿[3]，提取并纯化淫羊藿苷[4]，分别通过体内、外实验评价淫羊藿苷的雌激素样作用，为更年期妇女保健及雌激素依赖性肿瘤(如乳腺癌、子宫内膜癌等)患者的临床用药提供指导。
1 材料与方法
1.1 淫羊藿苷的提取及纯化[4]
淫羊藿纯化、浓缩后，总干燥物中淫羊藿苷含量为62.3%。淫羊藿药材为免煎剂，购自西安交通大学医学院第一附属医院中药房，生药含量300mg/mL。
1.2 动物、分组及给药
昆明种小鼠80只，雌性，出生后21d(断乳鼠)，体重9～12g，购自西安交通大学医学实验动物中心，二级动物室饲养。阳性药物为雌二醇注射液(E2)，2mg/mL，北京益民药业有限公司生产，用植物油配制成35μg/mL的悬浊液。实验动物按体重随机分为4组：阴性对照组、阳性对照组、淫羊藿组以及淫羊藿苷组，每组20只。实验动物适应性饲养6d后，阴性对照组给予等体积植物油；阳性对照组按0.35mg/(kg·d)给予E2；淫羊藿组按3g/(kg·d)给予淫羊藿；淫羊藿苷组按3.5mg/(kg·d)给予淫羊藿苷。早、晚各灌胃1次，连续4d。各组动物于最后1次给药后第2天，取10只称重，脱臼处死，心脏取血，分离血清，ELISA法测定雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)水平；分离子宫并称重，计算子宫系数(即：子宫湿重/体重×100%)。另10只眼眶后静脉丛取血，4℃存放过夜，2000r/min离心10min，小心分离血清，56℃ 30min灭活补体，0.22μm微孔滤膜过滤，-20℃贮存，供细胞培养用。
1.3 细胞培养试剂及仪器
DMEM(高糖)、无酚红DMEM(高糖)、活性炭葡聚糖苷处理的胎牛血清(CDTFBS)为Hyclone公司产品；小牛血清(中国医学科学院生物工程研究所)；E2、MTT、DMSO(Sigma公司)；ICI 182，780(Tocris公司)。雌激素敏感性人乳腺癌MCF7细胞购自中科院细胞生物研究所细胞库。CO2培养箱(BD)；酶联免疫检测仪(EPSON LX800)；倒置显微镜(Olympus)。
1.4 细胞培养
人乳腺癌细胞系MCF7于含100mL/L小牛血清的DMEM高糖溶液中培养，培养条件为37℃、50mL/L CO2、相对饱和湿度。实验开始前4d将细胞用PBS洗涤2次后，改为在无酚红DMEM(含50mL/L CDTFBS)中培养，以耗尽细胞内储存的雌激素。
1.5 MTT细胞增殖实验
MCF7细胞经无酚红DMEM(含50mL/L CDTFBS)培养4d后，选取对数生长期细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化，PBS(pH 7.4)洗2次，加入无血清DMEM，以每孔2×103个的浓度接种于96孔板内。培养24h待细胞贴壁后，换为含100mL/L试验血清的DMEM培养液继续培养，每种血清设8个复孔。分别于24、48、72h时，加入MTT(5g/L，每孔15μL)继续孵育4h，弃去培养液，每孔加入DMSO 150μL，震荡5～10min，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶联免疫检测仪在570nm下测定各孔吸光度(A)值，计算平均A值和增殖率(proliferation rate，PR)。PR=(实验组A值/阴性对照组A值)×100%。
1.6 ICI细胞增殖拮抗实验
取经无酚红DMEM(含50mL/L CDTFBS)培养4d后的MCF7细胞，以每孔2×103个接种于96孔板。培养24h待细胞贴壁后，换为含100mL/L试验血清的DMEM培养液继续培养，各孔分别加入ICI(终浓度：1×10-8mol/L)，每种受试物设8个复孔。于72h加入MTT(5g/L，每孔15μL)，孵育4h后吸去培养液，以DMSO溶解，在570nm下测定各孔A值，计算平均A值和增殖率。
1.7 数据分析
采用SPSS 11.0统计软件包建立数据文件并进行数据处理。计量资料均数比较，经方差齐性检验后，采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，组间多重比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 淫羊藿及淫羊藿苷对性未成熟小鼠体重及子宫湿重的影响
淫羊藿及淫羊藿苷组小鼠体重增幅明显高于阴性对照组，且均能明显增加子宫重量，但增幅与E2对照组比较相对较小(表1)。表1 淫羊藿及淫羊藿苷对小鼠体重和子宫湿重的影响（略）
2.2 淫羊藿及淫羊藿苷对性未成熟小鼠血清E2、LH、FSH水平的影响
与阴性对照组比较，淫羊藿苷可明显提高血清雌激素水平，降低FSH水平，但淫羊藿组仅表现为FSH水平降低(表2)。
2.3 淫羊藿及淫羊藿苷对MCF7细胞增殖及增殖拮抗的影响
在24、48、72h，淫羊藿、淫羊藿苷对MCF7细胞增殖均有明显的促进作用，但与E2组比较细胞增殖作用明显较弱。加入ICI后，对细胞增殖作用均受到抑制，与阴性对照组相比无显著性差异(表3)。表2 淫羊藿及淫羊藿苷对小鼠血清E2、LH和FSH的影响（略）表3 MTT法检测淫羊藿及淫羊藿苷对MCF7细胞增殖及增殖拮抗的影响（略）
3 讨论
淫羊藿是一种传统的补益中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等多种功效。淫羊藿苷是其主要单体成分，对于改善心血管系统功能、调节内分泌、增强免疫、抗肿瘤等均表现出生理活性[1]。整体药理实验表明，淫羊藿及淫羊藿提取物可能具有雌激素样作用[5]，提示淫羊藿苷可能是发挥药理活性的主要物质。
本研究应用体内实验——小鼠子宫增重法检测受试物的雌激素样作用[6]。由于子宫含有大量的雌激素受体(ERs)，雌激素或具有雌激素活性的化合物通过与该受体结合，可诱发细胞内反应，使子宫的雌激素诱导蛋白(IPs)含量增加，而表现为子宫组织增生。为了减少内源性雌激素的分泌对实验结果产生的影响，本实验选用的是初断乳、性未成熟的雌性小鼠，以子宫湿重与体重之比作为评价雌激素活性的指标。实验结果显示，淫羊藿及淫羊藿苷均能明显诱导子宫增重，与文献报道淫羊藿或淫羊藿提取物具有雌激素样作用一致[7]；且淫羊藿及淫羊藿苷的子宫增重作用与E2比较相对较弱，提示植物雌激素的作用相对缓和。该结果为绝经期妇女因卵巢功能减退、体内雌激素水平低下而采取植物雌性激素替代疗法提供了安全性保证。
资料显示植物雌激素可改变体内E2、FSH、LH水平，发挥雌激素样作用。本实验结果显示，淫羊藿苷可提高小鼠血清雌激素水平，其机制可能是由于其所含的活性成分提高了LH水平，但其具体途径尚不清楚。而淫羊藿对血清雌激素影响不显著，这可能是由于其结构与雌激素类似，与下丘脑的ER结合，从而对促黄体生成激素释放激素(LHRH)、促卵泡激素释放激素(FSHRH)的分泌产生反馈抑制作用，导致垂体FSH、LH分泌减少，并最终导致血清雌激素水平无明显变化。但淫羊藿苷与E2相比雌激素作用相对较弱，再次从生化水平证实，植物雌激素作用相对缓和的特点。
资料显示植物雌激素如异黄酮植物雌激素，能明显促进动物的生长[8]。本实验结果显示，用药后动物体重增幅显著高于阴性对照组，提示淫羊藿及淫羊藿苷有生长促进作用。其原因可能是淫羊藿及淫羊藿苷直接作用于肌肉细胞的雌激素受体，促进动物肌肉蛋白质积累，使肌细胞增大，并促进肝脏蛋白质合成，使血清白蛋白等含量升高[9]。且有研究发现植物雌激素在作用于动物性腺轴的同时也作用于其生长轴，通过与下丘脑、垂体等部位雌二醇受体结合，降低生长抑素水平，从而提高生长激素(GH)水平，并上调肝脏GH受体，使胰岛素样生长因子1(IGF1)水平升高，从而促进动物生长[8]。
应用体外细胞培养，特别是通过检验受试物与雌激素依赖性肿瘤细胞增殖间的关系，不仅可揭示受试物的雌激素样作用，也可以进一步探索其发挥作用途径和机制[10]。MCF7细胞是A型雌激素受体(ERA)阳性的人乳腺癌细胞株，可特异性地与雌激素或雌激素样活性物质作用而增殖，对细胞增殖具有正性作用。选择性雌激素受体调节剂(SERM)与ERA结合，在不同的组织或在不同的生理条件下可产生雌激素样作用或抗雌激素样作用[11]。叶海涌等[7]研究淫羊藿苷及其衍生物淫羊藿素和去甲淫羊藿素的雌激素样作用时发现，体外直接给予淫羊藿苷未呈现促MCF7细胞增殖作用。可能是由于淫羊藿苷与其他黄酮化合物类似，需经过胃内水解反应以及大肠细菌作用，使糖苷水解成苷元，才能具有雌激素样活性。本实验通过灌胃途径给予小鼠淫羊藿及淫羊藿苷，取其血清，结合体外细胞培养，结果显示淫羊藿及淫羊藿苷对MCF7细胞增殖均有明显促进作用，但与E2组比较细胞增殖作用明显较弱。可见淫羊藿及淫羊藿苷经过体内一系列活化作用后，可促MCF7细胞增殖，均具有雌激素样作用。这一结果提示淫羊藿及淫羊藿苷的给药途径应为口服给药，以提高药效。
ICI是一种实验用ER完全拮抗剂，可以显著地减弱或抑制由配体与雌激素受体结合所引发的、受雌激素应答元件调节的信号转导系统的作用[12]。本实验结果显示，加入ICI可明显抑制淫羊藿及淫羊藿苷细胞增殖作用，提示淫羊藿及淫羊藿苷促细胞增殖作用可能使是通过ER介导而产生的，与E2对细胞增殖的机制类似，但其作用强度较为缓和。
综上所述，淫羊藿及淫羊藿苷具有雌激素样作用，且其作用强度较为缓和。本研究可为更年期妇女保健及雌激素依赖性肿瘤治疗的临床用药提供指导。
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