郑成，兰国勇

(广州大学化学与化工学院，广东广州510006)

摘 要：研究了二氢杨梅素的微波辅助提取法和重结晶纯化法，提取实验中考虑了微波照射时间、加热时间和料液比等因素对提取率的影响，确定的最佳提取工艺条件为：微波照射时间为2Orain；加热时间为50rain；料液比为1：10，在此条件下二氢杨梅素的提取率为25．11％；纯化实验以水为结晶溶剂进行多次重结晶，结果表明可有效的除去二氢杨梅素的杂质，二氢杨梅素的含量由53．75％到95．75％。

关键词：藤茶；二氢杨梅素；微波提取

1 藤茶及二氢杨梅素

藤茶系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄Ampelosis grossedentate(Hanf～Mazz)W．T．Wang的嫩茎叶，味甘、淡，性凉，具有清热解毒、祛风湿、强筋骨之功效，主治皮肤癣癫、黄疸型肝炎、感冒风热、咽喉肿痛等。广泛分布于我国的广东、广西、云南、湖南、湖jE、江西等省区，我国瑶族民间常采集其嫩茎叶，经加工揉制、干燥，制成保健茶饮用，至今已有数百年的历史。而二氢杨梅素(简称DMY)是一种多酚基双氢黄酮醇，又称蛇葡萄素，属黄羟酮类化合物。二氢杨梅素大量存在于葡萄科蛇葡萄属植物中，其中藤茶尤为特别。在部分地区的显齿蛇葡萄植物的幼嫩茎叶中，发现其春夏幼嫩茎叶中二氢杨梅素的含量达到样品干重的20％以上，最高部位—— 幼叶中的心叶可达4o％[1]。

作为一种不可多得的天然活性物质，二氢杨梅素具有消炎、止咳、祛痰、镇痛、抑菌、抗高血压、降脂、抗肿瘤、保肝护肝等诸多生理活性，[2]此外二氢杨梅素还有很强的抗氧化作用和良好的抑菌、抗病毒效果，极具开发潜力。

1．1 微波辅助法提取

1．1．1 微波原理

微波提取过程的原理是极性分子或偶极性分子在微波场的作用下，产生每秒钟约4．9亿次的超高速转动，极性组分产生偶极涡流，离子传导和超高频摩擦而在极短的时间内生高温，其作用一是强化了传递过程，热量通过微波转换得到而不存在传递问题，从而实现高强度的均匀加热；二是植物内极性分子吸收微波产生热量，发生汽化或膨胀，内渗透压增加的破坏细胞结构，使扩散孔道变大，提取变的容易。

目前，微波技术在人们的生产生活中应用越来越广泛，此法在黄酮类物质的提取上也取得了良好的效果。它在提取过程中具有反应高效性和强选择性等特点，且操作简便，副产物少，产率高及产物易提纯等优点．本法多用在药材的浸出上。

1．1．2 微波辅助法提取=氢杨梅素

目前，国内外已经有部分学者开展了从植物中提取二氢杨梅素的研究，主要有采用热提取法(煎煮法、回流提取法)、浸泡提取法(渗漉法、冷浸法)及超临界萃取法等提取方法。其中，对于热提取法和浸泡提取法这两类常规方法而言，常常存在着费时、费溶剂、效率低、重现性差、提取效率低等不足之处，而且所用溶剂通常有毒，易对环境和操作人员造成危害；而超临界萃取虽具有节省试剂、无污染等优点，但是回收率较差，为了获得超临界条件，设备的一次性投资较大，运行成本高，而且难于萃取强极性和大分子的物质，故寻找一种有效的、稳定的提取方法显得非常必要。而微波萃取法具有设备简单、适用范围广、萃取效率高、重现性好、节省试剂、污染小等特点，可以避免长时间的高温引起物质的分解，特别适合于处理热敏性组分或从天然物质中提取有效成分，是一种具有趣好发展前景的萃取分离方法。[3]

本实验通过对微波辅助法大规模提取藤茶中的二氢杨梅素，为微波技术应用到二氢杨梅素的大规模提取提供了客观的实验依据。

1．2 二氢杨梅素的纯化

鉴于二氢杨梅素作为一种不可多得的天然活性物质，对蛇葡萄属植物酮提取物的分离与提纯，有助于其开发成一种新型的保健品及天然食品抗氧化剂，据目前报道，二氢杨梅素的分离与纯化主要有柱层析法、薄层层析法、高效液相制备色谱法等，但这些纯化方法或所需设备昂贵，或操作复杂、效率较低，很难满足大规模工业生产的需求 [4]。生产过程中，重结晶是纯化物质常用的方法，该方法操作简单、分离效率高，适合工业化生产，本实验采用重结晶法对二氢杨梅素的分离与纯化进行探索。

2 材料与方法

2．1 主要实验材料和仪器

藤茶叶                 购于茶叶市场

97％A1CI3．6H2O       广州化学试剂厂

95％分析醇              广州化学试剂厂

二氢杨梅素纯品          自制

2．2 主要仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 二氢杨梅素的提取

将1000g于的藤茶叶用水充分浸泡(茶与水的比例为1：5)。在微波功率为300 W 的条件下预处理样品(因实验设备所至。需分3次预处理)。预处理后的样品以一定的料液比用压力锅加热提取。

2．3．2 二氢杨梅素的纯化

将粗产品溶解于沸水中(粗品与水的比例为1：100，即1g粗品加入100mL沸水中；电炉加热使其溶解，但不要超过5 min，以防二氢杨梅素在高温下分解)。趁热抽滤，收集滤液。让滤液自然冷却，收集析出物，将析出物重复上述操作。

2．3．3 二氢杨梅素的定性分析

二氢杨梅素的定性分析采用红外光谱进行，通过对纯品的标准红外图谱及自制样品的红外图谱进行对照来确定。红外光谱对化合物的鉴定和有机物的结构分析具有鲜明的特征性，它通过吸收峰的位置、吸收峰的相对强度以及峰的形状提供化合物的结构信息，其中以吸收峰的位置最为重要。

2．3．4 二氢杨梅素的定量分析

二氢杨梅素的定量分析采用可见光吸光光度计测量：按照2．3．1 2．3．1操作后，趁热抽取样品液0．5 mL于5OmL的容量瓶，精密加入5％的AIC13溶液15 mL，95％乙醇定容，摇匀后，抽取5 mL，置于另一个50 mL的容量瓶中稀释定容，摇匀后室温放置40 min，在404 nm的波长下进行可见吸光度的测定 5。

2．3．5 二氢杨梅素的纯度测定

精密称取二氢杨梅素样品0．051 g，加95％乙醇溶解并定容至50 rnL，精密吸取溶液1 rnL置于50mL的容量瓶中，精确加人5％AtCI3溶液l5 mL，加95％乙醇，定容至刻度，摇匀后室温放置40 min，于404 nm的波长下进行可见吸光度的测定。

2．3．6 黄酮提取率及二氢杨梅素提取率的计算

供试液通过2．3．4所测出的吸光度值A，代人回归方程y=6．42X-0．0156(X即为C)计算得出浓度C(mg／mL)，根据以下公式计算：

黄酮提取率％：V×50×10×C／0．5／G~loo％

V——溶剂的体积

C——浓度mg／mL

G——实验样品重量rng

二氮杨梅素提取率％：黄酮提取率％×0．89(0．89为二氢杨梅素在总黄酮中所占的质量分数，是经验数值)

2．3．7 二氢杨梅素纯度的计算

黄酮化合物纯度％：50×50×C／G×100％

C——浓度mg／mL

G——实验样品重量mg

3．1 标准曲线的制作

精密称取二氢杨梅素对照品10．50 mg，加95％乙醇溶解并定容至10 mL．精密吸取溶液0，0．1，0．2，0．3，0．4，0．5mL分别放于10 mL容量瓶中，精确加人5％ AlCl3溶液3mL，加95％ 乙醇，定容至刻度，摇匀后室温放置40 min，于404 tm 处侧定吸收度。以标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，(回归方程A=6．42x+0．0156，r=0．9998)，制定出以下标准曲线，见图1。

3．2 提取工艺条件的确定

3．2．1 微波照射时间的影响

各取1000 g藤茶，加5000ml自来水，充分浸泡后，放入微波炉依次照射10、15、20、25、30 min，以1：8的料液比用压力蒸汽灭菌锅加热50 min，趁热抽样按2．3．4测其吸光度值，结果如表2，并按2．3．6进行计算得出数据，通过相关数据做出图1。

以水为溶剂，其他条件不变的情况下，不同微波照射时间会影响到液料的温度和有效成分的溶出，从图3中可知，随着连续微波辐射时间的延长黄瞳的得率将逐渐增加，而且在20 min时有一最大值。微波辐射时间延长，最直接的影响就是溶出物增加，因为随着时间的增加，物料内细胞的结构被影响的程度越大，因此产品得率提高。但由于有效成分在这一条件下，其最大溶出量有限，因此在微波辐射一段时间后黄酮的提取率变化不大，而另一方面微波时间过长，可能使藤茶叶烧焦或者烧糊，影响提取率。因此可以看出，选择在20min即可达到较好的提取目的。

3．2．2 微波照射后加热时间的影响

各取1000 g藤茶，加5000 mL自来水，充分浸泡后，放入微波炉依次照射20min，以1：8的料液比用压力蒸汽灭菌锅依次加热30、40、45、50、55、60 min，趁热抽样按2+3．4测其吸光度值，结果如表3。

茶叶经过微波处理后，细胞膜已经破碎，部分有效成分已溶出并附在了茶叶表面，从实验结果看，经微波处理后，提取率随加热时问的延长而升高。到50 min有个最大值，原因是经过微波处理后附着于茶叶表面部分有效成分溶到溶剂中去，同时在加热下，充分地对茶叶进行有效成分的提取，随着浸提时间的延长浸提越充分，提取率也就越高，但当加热到一定时间时，经过微波处理的提取率不再增加，原因一应该是二氢杨梅素随时间和温度的增加，变得不稳定，二应该是随溶出率提高，杂质量增大，故检出的提取率下降。可以看出经过微波处理后，进行加热时间50 min下提取率最高。

3．2．3 茶与水料液比的影响

各取1000 g藤茶，加5000 mL自来水，充分浸泡后，放入微波炉依次照射20min，依次以料液比1：6，1：8，1：10(因受实验设备限制最多可以做到1：10)用压力蒸汽灭菌锅加热50 min，抽样按2．3．4测其吸光度值，结果如表4。

可以看出，随着溶剂用量的增加，二氢杨梅素的提取率也增加，(由于受实验设备的限制，料液比最大只能做到1：10，根据有关文献报道，料液比应该在1：20时比较理想。)在中药的提取过程中，溶剂用量与物质的溶出有一对应的平衡关系，即有一个(饱和)溶出度的问题。溶剂用量的最低限度是保证物料刚被全部浸没，随着溶剂用量的增加，溶剂与物料之间的浓度差越来越大，物质溶出也越来越容易，溶出量随之增加。这时虽然提取物的产量会提高，但其中有效成分的相对含量会降低。

3．3 重结晶纯化

3．3．1 重结晶纯化二氢杨梅素

显齿蛇葡萄提取物中主要成分二氢杨梅素是极性化合物，在其水提物中，不可避免地含有单宁质蛋白质、糖类、盐类以及色素等杂质，这些杂质以结合态或游离态形式与黄酮提取物共存，因此显齿蛇葡萄提取物总黄酮化合物含量为86％左右。二氢杨梅素在100℃左右热水中的的溶解度约为冷水的20倍，而且采用水加热重结晶提纯法具有操作简便、安全、廉价的特点，可认为是首选方法[61。

3．3．2 重结晶次数与结晶物纯度关系

原料中单宁质含量高达l2％，是粗黄酮提取物产生苦涩味的主要物质，经过多次重结晶大部分的单宁质、色素留在结晶母液中被去除。结果见图2。

由图2可知，以水为溶剂，经6次重结晶，黄酮提取物中黄酮化合物的纯度则由粗品中的53．75％升高至5．75％，黄酮化合物的纯度随重结晶次数的增加而呈线性增加，但4次重结晶后结晶纯度升高幅度变缓。且得率随重结晶次数的增加也见减少，黄酮化合物在水相中的结晶为针状晶体。

3．3．3 外光谱图

取纯化后的二氢杨梅素少量加入KBr均匀混合，以压片法测定红外光谱，结果如图3，二氢杨梅素的标准红外光谱见图4。

图3为二氢杨梅索的红外光谱图，与参考文献资料图谱图4相比较可以判断，该红外图谱是二氢杨梅素的红外图谱，对其进行结构解析结果见表5。同时对照二氢杨梅索的结构图，见图5，结果显示其具有黄酮类物质所具备的特有基团；酚羟基、环酮基、苯环以及环醚等基团。

4 结论

(1)微波预处理对于黄酮类物质的提取率有所帮助，且提取率随微波处理时间的增加而增加，但处理时间不宜过长，一是有效成分最大溶出量有限，二是处理时间太长，可能使藤茶叶烧焦或者烧糊，而起不到提高提取率的作用。

(2)由于二氢杨梅索在冷水中的溶解度太低，宜用热提，且提取率随加热时间的增长而增加，但加热时间不宜过长，一方面二氢杨梅素随时间和温度的增加变得不稳定，另一方面杂质的

量增大，给纯化增加难度。

(3)溶剂的用量与物质的溶出有一对应的平衡关系，合理的料液比有助于提取率的增加，但同时应当考虑到水资源及能源消耗的问题。

(4)以水为溶剂，采用重结晶法可有效的提高黄酮化合物的纯度，经6次重结晶，黄酮纯度由粗产品的53．75％升高到95．75％。黄酮化合物的纯度随重结晶次数的增加成线性升高。

(5)二氢杨梅素在水中自然结晶，其形态为针状晶体，在水相中随时间和温度的增加会变的不稳定，所以应避免过高的加热温度。

参考文献

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[4] 张友胜．宁正祥．杨伟丽著．藤茶学[M]．广东科技出版社．2003．

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