许海棠1, 徐远金1 , 2

(1 广西大学糖业工程技术研究中心 南宁 530004；2 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室 南宁 530004)

摘要 建立了同时测定蒲公英颗粒中绿原酸、咖啡酸和阿魏酸3 种酚酸物质含量的HPLC-MS 方法。样品用含5%甲酸的甲醇溶液超声提取后，在Zorbax Eclipse XDB-C18 (2.1 mm ×150 mm, 5 μm)色谱柱上，以含0.2 %甲酸的水(A)-乙腈(B)体系为流动相，进行梯度洗脱，线性梯度洗脱程序为：0 min，5% B；1.5 min，10% B；10~15min，40%B；流速：0.25 mL/min；在ESI 正离子模式下，采用选择性离子监测方法进行检测。结果显示，绿原酸、咖啡酸和阿魏酸的线性范围分别为 0.050～20.0、0.030～20.0 和 0.100～20.0 μg/mL，检出限分别为0.010、0.006 和0.020 μg/mL。平均加标回收率为96.4 % ～ 101.6%，相对标准偏差为1.2%~2.6%。样品在10 h 内测定基本不变，可用于蒲公英颗粒的质量控制。

关键词 蒲公英颗粒绿原酸 咖啡酸 阿魏酸 高效液相色谱-电喷雾质谱法

蒲公英颗粒是由蒲公英加蔗糖等辅料制成的颗粒剂，具有清热消炎的功效，用于治疗上呼吸道感染、急性扁桃体炎、疖肿、乳腺炎等。目前，关于测定蒲公英草药及其制剂中的绿原酸、咖啡酸和阿魏酸的含量已有报道，例如，曾秋华等用高效液相色谱法测定蒲公英颗粒中的咖啡酸[1]，周小平等以高效液相色谱法测定蒲公英中的绿原酸[2]，晏媛等用高效液相色谱法同时测定蒲公英中咖啡酸和阿魏酸[3], 李文用高效液相色谱法测定蒲公英片中的绿原酸和咖啡酸[4]。但是，尚未见有对蒲公英及其制剂中绿原酸、咖啡酸和阿魏酸这3种酚酸类物质同时测定的报道。本文利用高效液相色谱-质谱法联用技术，采用选择性离子监测(SIM)方法，建立了HPLC/MS同时测定蒲公英颗粒中绿原酸、咖啡酸和阿魏酸的方法，并已成功地用于药品蒲公英颗粒的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100 LC/MSD Trap SL 高效液相色谱-质谱联用仪(德国)； Waters pro plus 超纯水仪(美国)； Sartorius ME 215S 电子分析天平(德国)。乙腈（色谱纯，Fisher 公司)，其他试剂均为分析纯，所有用水均为超纯水；对照品绿原酸、咖啡酸、阿魏酸购自中国药品生物制品检定所；样品为安庆汇达丰药业有限公司生产，规格为每袋15 克，10 袋/盒，批号分别为20061118、20070129、20070317。

1.2 对照品溶液的制备

分别准确称取绿原酸、咖啡酸和阿魏酸对照品各10mg，分别置10 mL 量瓶中，用含5%甲酸的甲醇溶液溶解并定容，振荡均匀后即得浓度为1.00 mg/mL 的对照品储备液。其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。由于绿原酸和阿魏酸遇光不稳定，操作过程要注意避光，使用前配制。

1.3 供试品溶液的制备

取蒲公英颗粒适量，研细，混匀，准确称取0.400 g 置锥形瓶中，加入含5%甲酸的甲醇溶液40 mL，超声提取30 min，移入50 mL 量瓶并定容。用时摇匀，静置，吸取上清液经0.45 μm 的微孔滤膜滤过，备用。

1.4 色谱和质谱条件

采用 Zorbax Eclipse XDB-C18 (2.1 mm ×150 mm, 5 μm)色谱柱，美国Agilent 公司；流动相A：水（含0.2%甲酸），B：乙腈（含0.2%甲酸）；采用线性梯度洗脱程序进行洗脱（0 min，5% B；1.5 min， 10%B；10 ~15min，40%B），流速为0.25 mL/min；柱温:25 ℃；进样量：5 μL。电离源为电喷雾电离源正离子模式，采用选择性离子监测(0~8.8 min，m/z 355；8.8~10.0min，m/z 181； 10.0~15min m/z 195)。毛细管电喷雾电压:4.0 kV； 雾化气(N2): 20.9 kPa；干燥气(N2):流速8 L/min；温度300℃。

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择

据文献报道[5]，绿原酸和阿魏酸不稳定，尤其是阿魏酸遇光、遇热易分解。本文对比了采用50%甲醇水溶液、100%甲醇溶液和含5%甲酸的甲醇溶液对样品进行超声提取，结果表明采用含5%甲酸的甲醇溶液处理样品时提取率高，稳定性好。

2.2 流动相的选择

本文对常用流动相甲醇-水和乙腈-水进行了考察，实验结果表明，使用乙腈-水比甲醇-水作流动相时灵敏度略高。实验中探讨了将0~0.5%的甲酸溶液加入到流动相中对质谱灵敏度和色谱分离效果的影响，发现随着流动相中甲酸浓度的增大，色谱峰形对称性好，绿原酸的离子强度增强，而阿魏酸的离子强度则有所减弱。最终选择在流动相中加入0.2%甲酸的乙腈-水为流动相进行线性梯度洗脱。

2.3 质谱条件的优化

有文献报道，采用液相色谱-质谱测定藜蒿中绿原酸[6]、测定绿原酸的水解动力学及鉴定水解产物[7]和测定水溶性迷迭香提取物中的阿魏酸和咖啡酸[8]时，均是在负离子模式下进行扫描。本文分别采用了正离子模式和负离子模式进行对比，发现在本试验条件下，采用正离子模式扫描，对3种酚酸的检测较灵敏。由于阿魏酸遇光、遇热易分解[5]，本文比较了常用雾化室温度300~350℃对电离的影响，结果表明，雾化室温度采用300℃比较适宜。在选定的色谱-质谱条件下，被测组分间获得较好的分离，色谱图见图1。根据峰的保留时间及质谱信息进行定性，其质谱特征离子图谱见图2。从图谱2 中，可以看出3 种酚酸的 [M+H]+峰较明显，因此，进行选择性离子监测时，我们分别对绿原酸(m/z)355；咖啡酸(m/z)181；阿魏酸 (m/z)195 的碎片离子进行监测。

2.4 线性关系及检出限

分别吸取对照品储备液适量，以含5%甲酸的甲醇溶液配制成浓度为0.050～20.0 μg/mL 的绿原酸系列溶液、浓度为0.030～20.0 μg/mL 的咖啡酸系列溶液及浓度为0.100～20.0 μg/mL 的阿魏酸系列溶液。取上述系列标准溶液各5 μL 进样分析,记录各色谱峰的峰面积。以各对照品的峰面积(3 次平均值)对其质量浓度(μg/mL)进行线性回归，得到回归方程和相关系数。以信噪比等于3 计，得到上述3 种组分的检出限，均列于表1。

2.5 精密度试验

准确吸取含绿原酸、咖啡酸和阿魏酸均为5.00 μg/mL 的混合对照品溶液，按1.3 节所述供试品溶液的制备方法准备测试液，在同一天内重复进样6 次，计算日内精密度RSD。结果3 种酚酸的峰面积的RSD 分别为0.68%，0.52%，0.79%，表明方法精密度好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置，在 10 h 内不同时间进样分析，测定峰面积，3 种酚酸的峰面积的RSD 分别为2.1%，1.7%，2.6%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置10 h 内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品6 份，按1.3 节供试品溶液的制备方法准备测试液，进行平行试验测定。结果该批样品的绿原酸的平均含量为0.255 mg/g, RSD 为2.5%；咖啡酸的平均含量为0.148 mg/g, RSD 为2.2%；阿魏酸的平均含量为0.101 mg/g, RSD 为2.5%。

2.8 加标回收率试验

精密称取已测知含量（绿原酸 0.255 mg/g，咖啡酸0.148 mg/g, 阿魏酸0.101 mg/g）的蒲公英颗粒0.200 g 共9 份，3 份为一组，按低、中、高 3 个浓度分别加入标准品溶液，按1.3 节供试品溶液的制备方法准备测试液并进行分析，分别计算3 种成分的平均回收率，结果见表 2。

2.9 样品测定

分别精密称取不同批号样品，按1.3 节供试品溶液的制备方法准备测试液并进行测定，每批样品进样6 次，根据外标法计算3 批蒲公英颗粒中的绿原酸、咖啡酸和阿魏酸含量。结果是，绿原酸含量分别为0.255 mg/g，0.248 mg/g 和0.267 mg/g ；RSD 分别为2.5%，3.4%和4.1% 。咖啡酸含量分别为 0.148mg/g ，0.156 mg/g 和0.179 mg/g；RSD 分别为2.2%，2.6%和 3.1%。阿魏酸含量分别为 0.101 mg/g， 0.0981 mg/g 和0.116 mg/g；RSD 分别为2.2%，2.6%和3.1%。

3 结论

本文建立的液相色谱-质谱同时测定绿原酸、咖啡酸和阿魏酸含量的分析方法，准确、快速且重复性好，可以用于蒲公英及其制剂的质量控制。

参考文献

[1] 曾秋华,刘文京, 唐晓晖. 中国药业, 2007,16(3):26~27.

[2] 周小平, 赵厚民. 江苏药学与临床研究, 2006, 14(3):211~212.

[3] 晏媛, 刘世霆, 许重远等. 中国现代应用药学杂志, 2006, 6(23):229~231.

[4] 李文琪. 安徽医药, 2005 (10): 744~745.

[5] 黄罗生, 郭健新, 刘咏梅等. 中成药, 2004 , 26 (2):134~136.

[6] 颜流水, 丁军军, 史蓉蓉等. 分析测试学报, 2006, 25(3):89~91.

[7] 卢建秋, 刘永刚, 韩静等. 中成药, 2006, 28(8):1225~1226.

[8] 许高燕, 刘莹雯, 银董红. 分析科学学报, 2006, 22(5): 567~569.