胡秋芬1, 2 　杨光宇2 　黄章杰2 　李海涛1 　尹家元2

1 (玉溪师范学院化学系, 玉溪653100) 　　2 (云南大学化学系, 昆明650091)

摘　要　研究了用微柱高效液相色谱法测定金银花中的几种多酚类物质(氯原酸、木犀草黄素、木犀草黄素272葡萄糖甙、木犀草黄素272半乳糖甙、槲皮素及槲皮素232葡萄糖甙) 的方法。金银花样品中的多酚类物质用甲醇加热回流提取,然后以Waters XterraTM RP18 (1. 0 mm ×50 mm, 2. 5 mm)微柱为固定相, 1%的醋酸和甲醇梯度洗脱为流动相分离,在该色谱条件下,金银花中6种多酚类成分在4 min内可达到基线分离;用紫外二极管矩阵检测器检测。方法标准回收率为97%～104%;相对标准偏差为1. 6%～2. 3%。测定了几种金银花样品中的多酚类物质,结果满意。

关键词　高效液相色谱,固相萃取,金银花,多酚,微柱

1　引　　言

金银花( lonicera japon ica)为忍冬科植物的干燥花蕾,它是一种“药食同源”的绿色天然产物,在我国分布广泛,产量较大,是一种重要的可再生资源[ 1, 2 ] 。多酚类物质(主要是黄酮类和氯原酸)是金银花的主要有效成分。目前对金银花中多酚类物质的测定,主要有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等,其中,高效液相色谱法是最常用的方法[ 3～6 ] 。由于微柱高效液相色谱具有流动相消耗少,分析时间短,可不分流直接和质谱联用等特点,近几年来得到了迅速发展[ 7, 8 ] 。实验研究了用微柱高效液相色谱分析金银花中多酚类物质的方法,金银花中6种多酚在4 min内可达到基线分离。方法用于几种金银花样品分析,结果满意。

2　实验部分

2. 1　仪器与试剂

Allaince高效液相色谱2质谱联用仪(美国Waters公司) ,包括2690分离系统(四元泵、柱温箱及自动进样器) ; 996紫外二极管矩阵检测器; TMD 热束质谱检测器;Millennium32色谱管理软件。甲醇:高效液相色谱专用( Fisher公司) ;水为石英亚沸蒸馏水并用Milli2Q50 (美国Millipore公司) 超纯水仪处理,电阻率大于18MΩ·cm;氯原酸,木犀草黄素,木犀草黄素272葡萄糖甙,木犀草黄素272半乳糖甙,槲皮素,槲皮素232葡萄糖甙标样(分别购于Fluka公司、Sigma公司和美国Chromadex公司,含量> 95% ) 。

2. 2　色谱条件

色谱柱:Waters XterraTM RP18 ( 1. 0 mm ×50 mm, 2. 5 μm) , Waters Sep2Pak2C18固相萃取小柱(1 mL, 30 mg, 30μm) ;流动相为: A. 甲醇; B. 1%醋酸溶液,按0 min (A 20% + 80%B ) , 1. 5min (A 40% + B 60% ) , 3. 0 min (A 80% + B 20% )的线性梯度条件,流速为0. 2 mL /min;进样体积2. 0 μL;检测波长为345nm。在上述色谱条件下,样品和标样的色谱图见图1。

2. 3　样品处理

样品粉碎后过0. 45 mm粒径筛,准确称取样品约0. 4 g,加入45 mL 80%甲醇水溶液加热回流45min,冷却,过滤并定容到50 mL,取5 mL滤液,以10 mL /min流速通过预活化好的Waters Sep2Pak2C18固相萃取小柱,弃去最初的3 mL,收集后面的2 mL,用0. 45μm针头过滤器过滤,进样2. 0μL进行分析。

3　结果与讨论

3. 1　分离条件的选择

用甲醇2水作流动相时有的色谱峰稍拖尾。这可能是因为酚羟基易产生电离,在固定相

表面有双重的保留机制。改用甲醇- 1%醋酸溶液作流动相可使酚的电离被抑制,成为中性分子在反相条件下的疏水缔合物, 使分离效果和峰型得到较大改善。实验表明, 按0 min (A 20% + 80% B ) , 1. 5 min (A 40% +B 60% ) , 3. 0 min (A 80% +B 20% )的线性梯度条件可使样品中的待测组分达到基线分离, 3. 2　检测波长的选择由紫外二极管矩阵检测器200～400 nm波长扫描可得各色谱峰的光谱图(图2) 。

样品中各多酚均由其保留时间及紫外光谱图与标样对照确定,并作了峰纯度分辨,确认各测定组分均达到完全分离;由于各多酚类物质在345 nm左右均有较大吸收,因此实验选择检测波长为345 nm。

3. 3　样品前处理

多酚类物质在极性有机溶剂中具有较大的溶解度,在热甲醇液中溶解性较好,故实验选用80%甲醇为提取剂。对于0. 4 g左右的样品,用40 mL浓度在70%以上的甲醇溶液加热回流提取0. 5 h以上可提取完全,实验选用80%甲醇45 mL加热回流提取45 min。

金银花中除含有多酚类物质外,还含有油脂类物、蜡质、色素等弱极性物质。该类物质会影响多酚类物质的检测,并且在本实验的流动相条件下不能完全洗脱下,在C18柱上残留积累,使色谱系统的反压增大,并降低柱效,故样品分析前需作脱脂处理。常规样品处理采用正己烷、石油醚等非极性有机溶剂进行脱脂,但是用有机溶剂脱脂时间长,操作麻烦,还会在一定程度上造成多酚类物质损失,影响分析结果。因此实验先用80%甲醇回流提取样品中的多酚类物质,提取液用C18固相萃取小柱脱脂的方法。用Waters SPE真空提取装置,每次可同时处理20个样,小柱活化和样品预分离的流速均为10 mL /min,小柱用3 mL甲醇活化,然后用10 mL水洗净小柱上的甲醇,取80%甲醇的样品提取液通过小柱。这样,弱极性物质脂类、蜡质、色素等保留在小柱上,而多酚类物质在小柱上不保留,可简便快速的达到样品纯化的目的,用固相萃取脱过脂的样品可直接进样进行色谱分析。

3. 4　回归方程、相关系数及检出限

分别配制浓度为100、20、4. 0 和0. 8 g/L的标准溶液,进样后根据不同浓度的峰面积计算出回归方程,结果见表1。根据信燥比S /N = 3,测得各组分最低检测浓度,结果见表1。

3. 5　回收率实验及精密度

准确称取相同样品两份,其中一份加入已知量多酚标样,另一份不加,每份样品平行测定5次,通过加入标准的测出量除以标准加入量计算回收率,并计算相对标准偏差,结果见表2。

3. 6　样品分析结果

金银花样品采集后按1. 3样品前处理的方法处理进样分析, 4个样品的分析结果见表3。

本方法采用甲醇回流提取金银花中的多酚类物质,用固相萃取预分离,微柱高效液相色谱法测定金银花中的6种多酚类物质,在4 min内可达到基线分离。分析时间比常规色谱柱明显缩短,而且流动相流速只需0. 2 mL /min,比常规色谱柱(流动相流速0. 5～2. 0 mL /min)流动

相消耗减少。用固相萃取预分离脱脂克服了用有机溶剂脱脂时间长、操作麻烦,会造成多酚类物质损失的缺点,而且固相萃取易实现操作自动化,使样品前处理更为简便快速,结果可靠,在一定程度上为金银花中的多酚类物质研究提供了方法。

References

1　Shi Yue (石　钺) , Shi Renbing (石任兵) , Lu Yunru (陆蕴如). Chinese Pharm aceutical Journal (中国药学杂志) , 1999, 34 (11) : 724～727

2　Zhao Guoling (赵国玲) , L iu J iajia (刘佳佳) , L in Dan (林　丹). Chinese Traditional PatentM edicine (中成药) , 2002, 24 (12) : 973～976

3　Sun Huiming (孙会敏) , Xing Cheng (邢　成). Chinese Journal of Pharm aceutical Analysis (药物分析杂志) , 2003, 23 (1) : 76～77

4　Zeng Xiaoying (曾晓英) , Ni Long (倪　龙) , Wang Baoqin (王保琴). Chinese Journal of D rug S tandards (中国药品标准) , 2002, 3 (1) : 19～22

5　Wang Dexian (王德先) , Zhao J ingxiang (赵敬湘) , Yang Genglian (杨更亮) , Zhang L ing (张　玲). Chinese Tradi2tional and Herbal D rugs (中草药) , 2000, 31 (6) : 432～438

6　L i Z, Wang L, Yang G Y, Shi H L, J iang C Q, L iuW. Journal of Chrom atographic Science, 2003, 41 (1) : 36～40

7　Fu Ruonong (傅若农). Chinese Journal of InternationalAnalytical Instrum entation Technology and Application (国外分析仪器技术与应用) , 2000, (4) : 1～10

8　Huang Tiehua (黄铁华). Chinese J. Anal. Chem. (分析化学) , 1998, 26 (6) : 748～751

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