李刚，郑作文，唐云丽(1.广西中医学院，南宁市530001；2.广西桂林市人

民医院，桂林市541002)

摘要  目的:研究藤茶总黄酮体外抗人肝癌细胞的作用。方法:以MTT法、细胞生长曲线法、集落形成法观察藤茶提取物对人肝癌BEL7404细胞的体外抑制作用。结果:藤茶总黄酮能显著抑制体外培养的BEL7404细胞的生长。MTT法测得的半数抑制浓度(IC50)为28.59μg·mL-1；细胞生长曲线法提示藤茶总黄酮对BEL7404细胞的生长有显著的抑制作用；集落形成法提示当药物浓度在22.22μg·mL-1以上时IC50为100%，当药物浓度在14.81μg·mL-1时IC50为58.05%。结论:藤茶总黄酮对体外培养的BEL7404细胞有显著的抑制作用。

关键词  藤茶总黄酮；人肝癌BEL7404细胞；体外抑制作用

藤茶Ampelopsisgrossedentata系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄的嫩茎叶[1]。从藤茶中提取的总黄酮具有调节血糖和血脂、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多项药理作用[2~4]。本文对藤茶总黄酮进行抗人肝癌BEL7404细胞的研究，以期为临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

Sunrise型自动酶标仪(奥地利Tecan公司)；311型二氧化碳培养箱(美国ThermoForma公司)；DLF560型超净工作台(荷兰ClearAirTechniekBv公司)；细胞培养瓶(加拿大Biofil公司)；96孔板(上海Sunub科技发展公司)；倒置显微镜(广西梧州光学仪器厂)；微量移液器(法国Pipetman公司)；十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)。

1.2 试药

藤茶总黄酮由广西中医学院中药化学教研室通过柱层折提取分离，为粉状淡黄色结晶，经含量测定，纯度为91.1%；RPMI-1640干粉(美国Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青公司，批号:031101)；MTT(北京拜尔迪生物公司，批号:0793)；二甲基亚砜(上海博大泰克公司)；0.25%胰蛋白酶(美国HycloneLab公司)；注射用生理盐水(徐州莱恩药业公司，批号:051122)。

1.3 细胞

人肝癌BEL7404细胞，由广西中医学院分子生物学实验中心惠赠。

2 方法与结果

2.1 BEL7404细胞的培养

在长满BEL7404细胞的培养瓶内加0.25%胰酶，37℃消化3~4min；1∶3传代，3~5d

长满。置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2 MTT法测定半数抑制浓度(IC50)[5]

取对数生长期的细胞消化，配制成1×104个·mL-1细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔180μL。设6个浓度的药物组及细胞对照组，每浓度4个复孔。药物组加不同浓度的藤茶总黄酮，每孔20μL，使其终浓度分别为75、50、33.33、22.22、14.81、9.88μg·mL-1；细胞对照组加培养液20μL。置于37℃、5%CO2培养箱中预培养48h；取出，加MTT(5mg·mL-1，生理盐水配制)，每孔10μL；继续培养4h，弃上清液，加入不含血清的1640培养液，每孔150μL，洗板1次；弃上清液，加入二甲基亚砜，震荡。在550nm波长处用酶标仪测吸光度(OD)值，计算抑制率，用对数回归方程求出IC50。肿瘤细胞生长抑制率按下式计算:肿瘤细胞生长抑制率=(1试验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。MTT法测定藤茶总黄酮对BEL7404细胞的抑制作用详见表1。

由表1可知，当藤茶总黄酮终浓度为75.00、50.00、33.33、22.22μg·mL-1时，抑瘤率

与细胞对照组比较有显著性差异(P<0.01)；按对数回归方程计算(r=95%)，其IC50为28.59

μg·mL-1，提示藤茶总黄酮有较强的体外抑制BEL7404细胞作用。2.3 生长曲线法测定[5]取对数生长期的细胞消化，配制成1×104个·mL-1细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔180μL。设6个浓度的药物组及细胞对照组，每浓度4个复孔。药物组加不同浓度的藤茶总黄酮，每孔20μL，使其终浓度分别为50、33.33、22.22、14.81、9.88、6.58μg·mL-1；细胞对照组加1640培养液20μL。置于37℃、5%CO2培养箱中培养，分别于用药后第0、1、2、3、4天用台盼蓝拒染法进行活细胞计数。以每1mL活细胞数为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。生长曲线法测定藤茶总黄酮对BEL7404细胞的抑制作用详见表2。

由表2可知，细胞培养第1、2天时，浓度为50.00、33.33μg·mL-1的藤茶总黄酮的抑瘤率与细胞对照组比较有显著性差异(P<0.01)；培养第3、4天时，浓度为50.00、33.33、22.22μg·mL-1的藤茶总黄酮的抑瘤率与细胞对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结果提示，藤茶总黄酮对培养的BEL7404细胞的增殖表现出显著的抑制作用，且成浓度-效

应关系。

2.4 集落形成法测定[5]

取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰酶溶液消化并吹打成单个分散细胞悬液，进行活细胞记数。用含10%新生牛血清的1640培养液稀释成100个·mL-1细胞，接种于24孔板中，每孔加入1mL细胞，后加入不同浓度的藤茶总黄酮，每孔1mL，使其终浓度分别为75、50、33.33、22.22、14.81μg·mL-1，每个浓度均设3个复孔；细胞对照组加1640培养液1mL，混匀。将24孔板移入CO2箱，在37℃、5%CO2及饱和湿度环境下，静置培养8d。弃去培养液，用姬姆萨应用液染色，在镜下计数大于50个细胞的克隆数。抑制率(%)=(1试验组克隆数/对照组克隆数)×100%。集落形成法测定藤茶总黄酮对BEL7404细胞的抑制作用详见表3。

由表3可知，当藤茶总黄酮终浓度为50.00、33.33、22.22μg·mL-1时，抑制率为100%；

当藤茶总黄酮终浓度为14.81μg·mL-1时，抑制率为58.05%。提示藤茶总黄酮有显著的抑制BEL7404细胞的作用。

3 讨论

恶性肿瘤是危害人类健康和生命的主要疾病。据世界卫生组织1976年估计，全世界每年约有500万左右的人死于恶性肿瘤。近几十年来， 由于生态环境的不断恶化、艾滋病等疾病的传播，恶性肿瘤的发病率呈上升趋势，并成为继心血管疾病之后的第二大致死病因。

目前，对肿瘤的治疗手段有显著进步，但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗尚未能达到令人满意的效果[6]。因此，从天然中草药中寻找有效的抗癌药物越来越受到人们的关注。本文采用MTT法、细胞生长曲线法、集落形成法对藤茶提取物体外抗肿瘤的作用进行了试验研究，结果显示，藤茶总黄酮体外对人肝癌BEL7404细胞的增殖有显著抑制作用。至于其体内抑瘤实验还有待进一步研究。

参考文献

[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第2册)[M].北京:科学出版社，1983:349~356.

[2] 钟正贤，陈学芬，周桂芬，等.广西藤茶提取物的药理研究[J].广西科学，1999，6(3):216.

[3] 钟正贤，周桂芬，陈学芬，等.藤茶提取物对链脲霉素所致糖尿病大鼠的降糖作用[J].中药药理与临床，2003，19(5):19.

[4] 朱海升，刘鄂湖，鞠娟，等.抗老年性痴呆的天然药物研究进展[J].中国药房，2007，18(3):223.

[5] 徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学[M].第3版.北京:人民卫生出版社， 2005:1785.

[6] 卜平.细胞信号转导与抗肿瘤中药开发(上)[J].江苏中医药，2003，24(4):1.