彭密军1,2 ，张敏1，刘建兰1，周春山2(1．吉首大学，湖南张家界427000；2．中南大学化学化工学院，湖南长沙410083)

[摘要] 目的：建立杜仲颗粒中两种活性成分京尼平苷酸和绿原酸快速、同时测定的方法。方法：采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定，C18色谱柱(250mm×4．6mm，5 m)，甲醇-水-冰乙酸(14.5：85：0.5)为流动相，流速1 mL·min-1 ，柱温25℃ ，检测波长236 nm，灵敏度：0．08 AUFS，进样体积6ul。结果：该方法线性关系良好，京尼平苷酸和绿原酸的回收率分别为99.03 ，99.99 ，测定结果RSD分别为0.134％ ，1.72%。结论：该法快速、可靠、简单、灵敏度高。

[关键词] 高效液相色谱法；杜仲颗粒；京尼平苷酸；绿原酸

杜仲颗粒系中成药，主要含杜仲皮和杜仲叶提取GPA)和绿原酸(chlorogenic acid，CGA)。该制剂能够增强机体的免疫功能，对细胞免疫功能具有双向调节作用；并有利尿、镇静及抑制肠道对胆固醇吸收的作用；还可调节子宫收缩，对先兆流产有很好的疗效；具有缓和而持久的降压作用[1~3]，并能与自由基结合抑制脂质过氧化反应，起到抗衰老作用[4~7]。本研究采用RP_HPLC法对杜仲颗粒中的两种主要活性成分GPA和CGA的含量进行同时测定，现报道如下。

1 材料

Biotronik液相色谱分析仪(德国BIoTRoNIK公司)。绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所)；京尼平苷酸标准样品(日本和光纯药业株式会社)；杜仲颗粒(贵州天方药业有限公司生产，批号：020422，020426，020428)；纯化水，乙醇，甲醇，冰醋酸为分析纯。试剂配制后应当用0．45 m微孑L滤膜过滤。

2 方法与结果

2．1 色谱条件及系统适应性试验

2．1．1 色谱条件色谱柱：Polygosil C 8色谱柱(250mm×4．6 mm，5 m)；流动相：甲醇一水一冰乙酸(14．5：85：0．5)；流速：1．0 mL·min-1，柱温：25℃ ，检测波长：236 nm；灵敏度：0．08 AUFS；进样体积6 ul。色谱图见图1。

2．1．2 系统适用性色谱柱理论塔板数(N)按京尼平苷酸计酸为5200，与相邻峰分离度≥ 1．5，拖尾因子为1.15；按绿原酸计算N为5500，拖尾因子为1.08。

2．1．3 测定波长的选择分别取绿原酸和京尼平苷酸对照品溶液于紫外光区190~400 nm 范围内进行扫描，CGA的最大吸收波长在325 nm，第二吸收波长为238 nm，GPA的最大吸收波长则在235 nm左右，确定236 nm为测定波长。

2．2 对照品溶液的制备准确称取GPA对照品6．8mg、CGA对照品7．1 mg，用色谱纯甲醇溶解并定容至5 mL，得到浓度为1．36 g·L-1的GPA、1．42 g·L-1的CGA对照品混合储备液，冷藏保存。

2．3 样品溶液的制备 准确称取0.1 g杜仲颗粒样品，加人适量50 的甲醇一水溶液，超声溶解20 min 2次，移人25 mL量瓶中，再用50%的甲醇一水溶液定容至刻度，摇匀，过滤。准确吸取滤液1.0 mL于10mL量瓶中，用流动相稀释、定容至刻度，摇匀。用0．45um滤膜过滤后，即得待测液。

2．4 线性关系考察取对照品储备液用流动相溶液稀释，配制成对照品系列混合溶液，GPA：0．034，0．068，0．136，0．272，0．544 g ·I -1 ；CGA ：0．034，0．071，0．142，0．284，0．568 g·L-1。各进样6ul，平行5次。结果GPA和CGA的峰面积y与其进样浓

度X(g·L-1)存在良好的线性关系：

CGA ：Y = 一608 71+ 4 322 500X ，r= 0．998 6，线性范围：0．036~0．568 g·L-1

GPA：Y = 一377 20+ 6 043 800X ，r= 0．996 9，线性范围：0．034~0．544 g·L-1

2．5 精密度试验精密吸取GPA含量为0．080 g·L-1；CGA为0．072 g·L-1 的样品溶液6 ul，重复进样5次，测得RSD分别为：GPA 0．61 %，CGA 0．72 %(n= 5)。

2．6 稳定性实验精密吸取GPA含量为0．080 g·L-1；CGA为0．072 g·L-1的混合溶液6 ul，每间隔一段时间进样测定一次，实验表明，该混合溶液在10 d内基本稳定。

2．7 加标回收率测定精密称取适量的已测定含量的样品5份，分别加人一定量的GPA、CGA对照品，采用2．3方法制备样品，过滤后分析，测定回收率，结果平均含量分别为99.03%，99.99%。

2．8 重复性试验 按“2．3”项制备杜仲颗粒样品溶液，进样6 ul，重复5次。试验结果测得GPA，CGA含量分别为0．799，0．712 mg·g-1，RSD 分别为0.134%，1.72%。

2．9 样品的测定分别对3批杜仲颗粒样品进行测定，各样品中GPA、CGA的含量测定结果见表1。

3 讨论

3．1 样品提取方法的选择取同一样品4份，分别加甲醇、乙醇、50％的甲醇及50%的乙醇同时超声波提取20 min提取，各两次，合并后测定其中GPA 和CGA含量。结果表明，50%的甲醇提取率最高，提取最完全，所以确定用50%的甲醇为提取溶剂。

3.2 测定方法的选择GPA及CGA的测定方法主要有分光光度法，薄层色谱法和高效液相色谱法等[3-8]。大多是对杜仲中的两种成分分别进行分析测定，而对杜仲制剂中的这两种化合物同时进行测定的方法未见有报道。高效液相色谱法能分离并检测各个有关组分，而且方法快速、准确。

3．3 流动相的选择 试验发现，仅以不同比例的甲醇一水为流动相，由于两种组分都有羧基，极性均很强，在C 18柱上都不易保留，很快被流动相洗脱下来，难以完全分离。流动相中加入醋酸，可抑制GPA 和CGA羧基的离解，延长其保留时间，从而使之与其他杂质分

离彻底。两色谱峰峰形都有所改善，所得色谱图峰形对称。甲醇一水一醋酸的比例为14．5：85：0．5时，所测定组分与附近分离较好，整个分析时间也较适宜(35 min可完成)。

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