赵昕 袁晓颖 付玉杰 张莹

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨150040)

摘要：以高效液相色谱法作为绿原酸含量的检测方法，用超声提取法从豚苹茎中提取绿原酸以制备分析样品，结果表明超声提取的最佳条件为：以蒸馏水为提取溶剂，在60℃下超声提取70min。

关键词：豚草；绿原酸含量；超声波提取法；高效液相色谱法

绿原酸(Chlorogenic acid)是由咖啡酸(eaffeiacid)勺奎尼酸(quinic acid)组成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙索类化台物。医学上具有利胆，抗菌，降压，增高白血球及兴奋中枢神经系统等多种药理的作用[1]。为众多药材(如金银花、杜仲)以及中成药(如复肝宁、粉刺口服液等)的主要成分。因此探讨制备绿原酸分析样品的最适提取工艺条件对于其他富含绿原酸的植物资源的利用有着重要的指导意义。

近年来绿原酸含量的提取方法主要有水提醇沉[1]、醇提铅沉、水提石灰乳沉淀法等[3]。水提醇沉使得绿原酸在提取过程中有一些损失，醇提铅沉给产品带来重金属铅的污染，水提自-灰乳沉淀法存在着得率较低、易分解的缺点。以上提取方法作为绿原酸分析样品的提取方法存在结果偏低的问题．故本文以高效液相色潜法[3,5-7]作为测定豚草茎中绿原酸含量的方法，以水为溶剂超声提取和95％乙醇为夹带荆超临界萃取豚草茎中绿原酸制备了分析样品，测定了豚草茎中绿原酸含量。

l仪器和材料

DK-98-1电子恒温水浴锅，JASCO高效滴褶色谱仪，975型紫外检测器，BIOFUGE22R高速冷冻离心机，ABl04型电子天平，PHARMARIA恒温水浴，DS-300A超声波清洗机，HALZL-50- Ol超临界CO：苹取仪。乙腈、甲醇为色谱纯．其余试剂均为分析纯。绿原酸标准样品由中国药品生物制品检定所提供．豚草于2001年8月采于牡丹江地区，取其茎于80％烘干至恒重，粉碎至40目。

2实验方法

2．1 绿原酸含量的高效液相色潜分析

2.1.1色谱条件  色谱柱KYATECH(日本)ODS柱(4．6mm×25cm，5Um)；流动相：乙腈：水：冰乙酸(体积比)=10：90：5；流速：lmL／min；检测波长：325 nm；进样量10uL。

2.1.2标准溶液的配制

精密称取绿原酸标准样品10mg于100mL容量瓶中，以甲醇为溶剂超声助溶，待冷却至室温定容，备用。

2.1.3标准曲线的绘制

分别精密吸取绿原酸标准溶液0.125、0.25、0.5、 1、2、4、6、8mI．于10mL容量瓶中，用甲醇稀释量刘度摇匀。按照上述色谱条件分别取稀释后样^6及原标准溶液进样分析。每个样重复三次，取峰嘶积平均值，得峰面积(Y)与绿原酸浓度（X）的线性回归方程为：Y=2×10⁷X一3l 962，相关系数R=0．999。在该条件下，绿原酸浓度的线性范围为0．001 25～0．01 mg／mL。

2．1．4绿原酸提取率的测定

将超声法提取并定容后的样品在上述色谱繁件下分析后．按下面公式计算绿原酸的提取率：绿原酸提取率‰=绿原酸浓度×提取液体积／豚草茎粉质量×1000

2．2分析样品的制备

2．2．1超声提取法

精密称取豚草茎粉10克于100mL锥形瓶中，加60ml。蒸馏水，提取温度、提取时间按2因素Ⅱ水平U_Ⅱ*(11 ²)的均匀实验设谤进行，每个样作三次重复，将提取液移人25mL定容瓶中冷却至室温，再用蒸馏水定容至刻度，15 000r／min离心20min，静置取七清液．在上述HPLC条件F检测，每个样重复测三次，计算绿原酸提取率。

2．2．2超临界萃取法

用95％乙醇溶液200ral。浸润豚草茎粉200克，24小时后在30Mpa压力、60℃下萃取90 min，15 000r／min离心20min，静置取上清液，在上述HPLC条件下检测，每个样重复测三次，计算绿原酸提取率。

2．3精密度

精密称取5份豚草茎粉，每份10克，按照确定的方法制备分析样品，并在选定的色谱条件下分析绿原酸的含量，测得平均提取率0．040 3‰．相对标准偏差为1．24见表1。

2.4回收率测定

精密称取3份豚草茎粉．每份50克，分别加入绿原酸标准晶2毫克。按照确定的方法制备分析样品，并在选定的色谱条件下分析绿原酸的含量，测得平均阿收率96．1％见表2。

3结果与讨论

3．1 结果

通过均匀实验的结果分析表明，超声提取的最佳条件是以水作为溶剂，在60℃下提取70min。在最佳条件下测得豚草茎中绿原酸提取率0．0407‰。以95％乙醇为夹带剂超临界CO2萃取豚草茎中绿原酸，测得提取率为0.001877‰

4讨论

实验是通过U_Ⅱ*(11 ²)均匀实验没计表(见表3)进行的，连同结果一并列于表中。

对结果进行逐步回归分析(引入变量F 检验值F1=0.050，剔除变量F一检验值F2=0.050)得如下回归方程：Y=0.044 216 1一O．001 784 0X1一0 000 318 0X2+0．000 027 4X1X1+0．000 0071X1X2 +0.000 000 6X2X2置其中：X1一提取温度X2一提取时间

回归方程的F=5，642 3>Fa(0．050 0)=5 050 0显著．回归方程有意义。复相关系数

R=0．921 7，残差标准差S=0．006 7，残差平方和SE=0．000 2，通过回归方程的计算可以

得出在60℃时提取率最大，即最优解X1=60，X2=110。对影响绿原酸提取率的各因素进行逐步回归模型分析，得到各因素对绿原酸提取率影响的变化曲线图(图1、图2)。从图中可以看出，提取温度对提取率的影响较大，并且呈现从1O℃至25℃提取率逐渐降低，在25％时提取率达到最低，超过25％随温度的不断升高提取率逐渐升高，但温度过高对植物的次生代谢产物会有影响，因此，温煌不宜选取过高以60％为宜。提取时间对绿原酸提取率的影响不大。以95％乙醇为夹带剂超临界CO2萃取豚草茎中绿原酸，测得提取率为0．001 877‰，可见超声提取法的得率明显高于超临界CO2萃取法的得率，而且具有操作简单，提取原料成本低，提取时间短的优点。

参考文献

1．戚向阳，张声华．杜仲叶绿原酸的提取、分离和鉴定，植物资源与环境，1998．7(1)：6l～62

2，高锦明，张鞍灵，张康健，等．绿原酸的分布、提取与生物活性研究综述，西北林学院学报，1999，14(2)：7{～82

3．郑荣庆，李光秀．高技液相色谱法在中药材资源开发等方面的应用．西北药学杂志，1994，9(4)：183～1．84

4李稳宏，吴红．季多伟，等．阿种醇沉方式对杜仲水捉液中绿原酸含量的影响．陕西师范大学学报(自然科学版)，1997，25(1)：65～66

5．伺心，石春伟，芦松萍．等．高教液相色谱法测定双黄琏粉针中绿原酸和咖啡酸吉量．药物分析杂志．1997，17(6)：410—411

6．孙永定，文旭．中成药的优良度——含量测定问题云南中医学院学报，(995，18(4)：13～18

7．王天志，李永梅，王志宵．金银花中3种有机酸的高效液相定量分析．药物分析杂志，2(X)0，20(5)，293～29

8王洋．张璞，于涛．等．高效液相色谱法测定红景天甙含量方法的研究植物研究，200(．21(1)113—115

产品链接：

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